Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Le flux de travail consiste à cultiver des cellules dans des conditions environnementales strictement contrôlées, à les refroidir rapidement à l’aide d’eau de fonte / glace et à les fixer avec une concentration pré-optimisée de formaldéhyde et un temps d’incubation. La réaction de fixation est ensuite éteinte en utilisant un excès de composés contenant des groupes aminés primaires, tels que la glycine ou les tryps. Les cellules sont collectées, lavées et peuvent être conservées congelées.

Les cellules fixes peuvent être lysées mécaniquement ou chimiquement, et le lysat est utilisé pour la séparation des fractions ribosomiques en fonction de leur taille moléculaire, de leurs propriétés de sédimentation ou de leurs marqueurs d’affinité. L’approche aboutit à un matériau polyvalent utilisable pour la purification et la détection immuno-assistées, l’enrichissement de complexes contenant des facteurs spécifiques en microscopie électronique. Lors d’un blocage profond réticulé, d’analyses basées sur l’amplification ou l’hybridation de l’ARN, le séquençage de l’ARN et la spectrométrie de masse deviennent possibles.

Installez une culture de levure d’un litre dans un agitateur orbital avec une densité optique de départ ne dépassant pas 0,05 unité d’absorbance à 600 nanomètres et utilisez des milieux de peptone et de dextrose à 30 degrés Celsius. Installez une centrifugeuse préparative avec des bouteilles de rotor et de centrifugeuse compatibles pour granuler la suspension liquide des cellules de levure à 5000 G à quatre degrés Celsius. Gardez une trace de la densité optique des cellules en croissance.

Il doit être compris entre 0,6 et 0,8 unité d’absorbance et 600 nanomètres au moment de la collecte si la phase de croissance exponentielle présente un intérêt. Une fois que les cellules sont prêtes, installez une glacière à l’intérieur de la hotte chimique avec un boulanger contenant 250 grammes de glace d’eau pilée propre et montrez-vous également 25 millilitres de trypsine et une solution de formaldéhyde stabilisée à 37% de méthanol fraîchement achetée à l’intérieur de la hotte. Versez la dernière culture cellulaire dans le boulanger contenant la glace.

Ajouter ensuite 75 millilitres de formaldéhyde à 37% à une concentration finale de 2,2% de poids sur le volume remuer intensément le mélange jusqu’à ce que la glace fonde. Une fois la glace fondue, installez une minuterie pendant 10 minutes Après l’incubation pendant 10 minutes, transférez la culture dans les bouteilles de centrifugeuse pré-refroidies et abattez les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius, 5000 G pendant cinq minutes. Pendant que le spin est, sur pré-refroidir un tube de 50 millilitres et garder le tampon A fraîchement préparé contenant de la glycine pour neutraliser tout formaldéhyde restant sur la glace.

Après la centrifugation, placez les tubes de centrifugeuse sur de la glace avec le côté granulé en contact avec la glace. Apportez les tubes dans la hotte et jetez le surnageant dans un conteneur à déchets de formaldéhyde. Remettez en suspension la pastille de cellule à partir de vieux tubes dans 20 millilitres de tampon A à l’aide d’une bandelette de 25 millilitres et transférez-la dans un tube de 50 millilitres.

Porter le volume à 40 millilitres avec le tampon A et prélever les cellules de lavage par centrifugation de quatre degrés Celsius, 5000 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez-la en suspension dans le tampon A one de 40 millilitres, qui est un tampon A ne contenant pas de glycine pour éliminer la contamination par la glycine. Abattez à nouveau les cellules par centrifugation à quatre degrés Celsius, 5000 G cinq minutes.

Répétez les lavages avec le tampon A une fois de plus. Jetez le surnageant et placez la pastille de cellule sur de la glace. Pesez le tube avec la pastille, la masse cellulaire humide doit être d’environ un gramme par litre de culture cellulaire.

Remplissez le polystyrène de la boîte recouverte de papier d’aluminium avec de l’azote liquide jusqu’à une profondeur d’environ trois centimètres. Placer à 50 millilitres de tube à la verticale dans la boîte. Re-suspendez la pastille dans 550 microlitres de tampon A deux par pipetage et vortex pendant 10 secondes.

Ajouter 10 microlitres de 40 unités par microlitre inhibiteur de la RNase et vortex à nouveau pendant 10 secondes. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, égoutter la suspension cellulaire dans les deux millilitres de 50 millilitres contenant l’azote liquide. Pour vous préparer à l’étape suivante, pré-refroidissez des tubes sans noyau de 1,5 millilitre sur de la glace carbonique et des pots de broyage en acier inoxydable de 10 millilitres.

Transférez les gouttelettes de suspension cellulaire congelées dans les bocaux à l’aide d’une spatule stérile propre. Immergez les pots de broyage dans de l’azote liquide pendant une minute, en vous assurant que la phase liquide reste au-dessus de la jonction. Installez un mélangeur Cryo à 27 Hertz pour l’agitation pendant une minute.

Agiter les pots de broyage scellés à 27 Hertz pendant une minute dans le broyeur mélangeur. Refroidir à nouveau les pots dans de l’azote liquide comme auparavant et agiter encore une minute. Transférez les pots dans la glacière contenant de la glace carbonique avec les tubes sans noyau de 1,5 millilitre.

À l’aide d’une petite spatule en acier, transférez les résultats de la date de broyage rembourrée dans les tubes. Ensuite, stockez les tubes à moins 80 degrés Celsius. Dans deux flacons T175, on développe 293 cellules HEK jusqu’à une confluence de 60 à 70 % et le milieu Eagle modifié de Dalbeko et le sérum bovin fœtal à 37 degrés et 5 % de dioxyde de carbone.

Au moins trois heures avant le temps de fixation souhaité, remplacez le support de la fiole T175 par précisément 30 millilitres de support complet préchauffé. Préparez une glacière à ras bord avec de la glace d’eau pilée et conservez-la dans la hotte avec les tampons nécessaires, ainsi qu’une glace. Pour refroidir les cellules, retirez la fiole T175 de l’incubateur et appuyez-la formellement contre la glace pour assurer un contact maximal avec la surface.

À l’intérieur d’une hotte à fumée chimique, inclinez la fiole sur le côté afin que le milieu s’accumule sur le côté opposé aux cellules. Pipette 168 microlitres de 37% pesés en volume de formaldéhyde directement dans le milieu groupé. Donner une concentration finale de 0,2% de formaldéhyde.

Mélangez immédiatement. Incuber les flacons sur de la glace pendant 10 minutes de plus. Versez le milieu dans un récipient à déchets approprié à travers le côté de la fiole opposé aux cellules.

À l’aide d’un strippete, pipette dans 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko sans ions calcium et magnésium et contenant en outre doucement 50 millimolaires de glycine sur le côté opposé aux cellules. Mélanger en berçant la fiole, remettre le flash en position horizontale et incuber pendant 10 minutes de plus sur la glace. Verser la solution à travers le côté de la fiole opposé à la cellule et ajouter doucement sept millilitres de solution standard d’EDTA de trypsine à 0,25% pour détacher et suspendre à nouveau les cellules.

Incuber la fiole à température ambiante pendant cinq minutes au maximum 10 minutes. Localisez la fiole verticalement et à l’aide d’un strippete, recueillez les cellules détachées en lavant doucement tout ce qui reste des parois de la fiole et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres posé sur de la glace. Complétez immédiatement la solution de suspension collectée avec 20 millilitres de support complet et mélangez en retournant doucement le tube.

Abattez les cellules en centrifugant le tube à 100 G pendant cinq minutes et quatre degrés Celsius. La pastille de cellule doit être clairement visible. Versez le support et remettez doucement la pastille dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko sans glycine.

Centrifuger à nouveau le tube à 100 G pendant cinq minutes et à quatre degrés Celsius Verser le tampon de lavage et suspendre à nouveau la pastille dans 800 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dalbeko glacée sans glycine, mais contenant des ions magnésium et calcium. Transférer les cellules en suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines. Centrifuger le tube à 100 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’un millilitre pipetter. À ce stade, la pastille cellulaire peut être congelée à moins 80 degrés Celsius ou passer à l’étape de lyse cellulaire. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse à base de détergent non ionique et non dénaturant, et sept microlitres d’inhibiteur de l’arginase et mélangez bien en pipetant à l’aide d’une pointe d’un millilitre.

Fixez soigneusement une aiguille de calibre 25 à une seringue d’un à trois millilitres et pipetez vigoureusement le mélange en utilisant au moins sept prises lentes vers le haut et des courses d’échappement rapides vers le bas. Jetez la seringue et l’aiguille dans le bac de l’aiguillon et répétez la procédure avec une aiguille de calibre 31 et une seringue de 0,3 millilitre. Jetez la seringue et l’aiguille dans le bac de l’objets tranchants.

Centrifuger le tube à 12 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines. Stockez les débris cellulaires et le lysat à moins 80 degrés Celsius.

Les complexes translationnels sont sensibles à la composition ionique des tampons. L’omission du chlorure de magnésium et l’ajout d’EDTA ont abrogé les propriétés de sédimentation élevées, et bien que le chlorure de calcium ait entraîné de meilleurs pics de résultat, l’amélioration était marginale. Nous avons donc choisi le tampon un.

Le formaldéhyde de 2,2 % masse par volume a parfaitement préservé les polysomes et n’a pas diminué le rendement global par rapport au formaldéhyde de 4 % poids par volume. Dans les cellules de mammifères, une concentration beaucoup plus faible de formaldéhyde de 0,2% poids par volume a été utilisée. Comme des concentrations plus élevées ont entraîné une perte substantielle de matière polyribosomale.

15 millimolaires d’EDTA ajoutés au lysat et tous les tampons ultérieurs ont montré un effet déstabilisateur nettement moindre sur les fractions polysomiques, dérivées des cellules fixes. Et cet effet a été partiellement répliqué avec de l’EDTA de 50 millimolaires avec un matériau provenant de cellules fixes à 4%, résistant, se déployant mieux. L’épuisement du glucose provoque l’un des effets inhibiteurs translationnels les plus spectaculaires et les plus rapides sur la levure.

Le désassemblage des polysomes induit par les conditions ajoutées au nerf et les conditions de cause locale étaient légèrement, mais évidemment plus de polysomes conservés dans le glucose faiblement ajouté. Il est important de noter que le matériau polysomique des cellules fixes démontre une grande distinction entre les cellules affamées et non affamées, ce qui indique l’adéquation de la fixation du formaldéhyde pour préserver les différences dans les processus translationnels dynamiques. Dans des approches telles que tacy paysake, il peut être également judicieux d’éliminer les petites sous-unités ribosomiques qui ne co-se déposent pas bien avec les rhizomes complets pour lesquels nous avons utilisé une ultracentrifugation en deux étapes, permettant l’isolement des diazomes résistants SSU, LSU, RS, RNase, DS et polysomes d’ordre élevé confirmés par microscopie électronique des fractions fixes.

Par rapport aux cellules non fixes, le matériau des cellules fixes a démontré une présence élevée d’eIF4A labile dans les fractions ribosomiques sédimentantes les plus rapides. En utilisant un matériau fixe de la souche eIF4A tapi pour capturer et enrichir les complexes contenant de l’eIF4A avec des billes magnétiques IDG, nous avons pu observer un enrichissement sélectif de l’eIF4A par rapport à la bêta-actine dans SSU et RS, mais pas les fractions LSU du deuxième gradient lors du démontage RNase one. Par rapport à d’autres méthodes de repos translationnel, la rapidité de l’action du formaldéhyde à travers les membranes cellulaires et la nature aveugle des liaisons croisées promettent la préservation de la diversité maximale des intermédiaires complexes de traduction.

Nos résultats conforment à la facilité d’utilisation de la fixation rapide du formaldéhyde pour stabiliser les complexes hautement transitoires et démontrent l’utilité dans les scénarios de réponses cellulaires rapides aux changements environnementaux ou aux conditions de stress.