Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3
22 février 2022
Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un fl
Les méthodes décrites dans ce protocole fourniront une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des ICM pour les études de reprogrammation cardiaque. Le flux de calcium est exclusivement observé dans les ICM et fournit un moyen d’évaluer la maturation fonctionnelle de l’ICM. Cette souche de souris simplifie les procédures d’évaluation et améliore la reproductibilité des résultats.
Ce protocole est une nouvelle méthode pour évaluer la maturation fonctionnelle des ICM dans le domaine de la reprogrammation cardiaque. Il peut également être appliqué pour évaluer la différenciation des cardiomyocytes et la fonction cardiaque. Commencez par obtenir huit à 10 petits, des chiots P0 à P2 pour isoler 10 millions de fibroblastes cardiaques néonatals, ou NCF.
Anesthésier profondément les chiots par hypothermie. Observez les cœurs au microscope à fluorescence pour vous assurer que le cœur avec le génotype souhaité montre un flux de calcium, indiqué par GCaMP3 avec les cœurs battant. Les autres génotypes ne montreront pas de fluorescence.
Après l’isolement des cœurs, coupez-les en quatre morceaux de manière à ce qu’ils soient vaguement connectés. Lavez-les soigneusement plusieurs fois dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS, dans une plaque de six centimètres pour limiter la pollution des cellules sanguines dans les cellules isolées. Digérez les cœurs avec huit millilitres de trypsine-EDTA chaude à 0,25% à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez le surnageant de trypsine et ajoutez cinq millilitres de 0,5 milligramme par millilitre de collagénase chaude de type deux dans la solution saline équilibrée de Hank. Vortex le mélange à fond et incubé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, encore une fois, vortexez le mélange à fond et laissez le tissu non digéré se déposer par gravité.
Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres avec cinq millilitres de fibroblaste froid. Diluer les cellules avec un milieu fibroblastique de telle sorte que la densité d’ensemencement soit d’environ deux à 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre cube. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plats ou des assiettes.
Les fibroblastes attachés doivent avoir une forme ovale à ronde le deuxième jour après l’ensemencement. Le jour zéro, ensemencez les NCF à la densité d’environ une à deux fois 10 à la quatrième cellule par centimètre cube dans le milieu fibroblastique. Le premier jour, remplacez le milieu de culture par un milieu contenant un virus pour chaque puits comme on le souhaite.
Le jour 2, 24 heures après l’infection virale, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu ICM ordinaire. Évaluez le flux d’ions calcium à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée à température ambiante. Observez les cellules GCaMP3 positives sous l’objectif 10X, en veillant à ce qu’elles montrent des cellules spontanées battant dans le canal du champ lumineux.
Les cœurs avec le génotype correct ont montré un flux d’ions calcium synchronisé avec les battements, visualisé comme la fluorescence GCaMP3. Bien qu’aucune fluorescence n’ait été observée dans les cœurs témoins. Isolés NCF attachés au puits dans les deux heures et ont montré une forme ovale à ronde un jour après l’ensemencement.
L’oscillation des ions calcium a montré un changement de fluorescence GCaMP3 entre le maximum et le minimum et l’oscillation des ions calcium de ces cellules a changé périodiquement. Après l’introduction de l’IMAP, le nombre de grappes battantes était significativement plus élevé que dans le groupe contrôlé, car le nombre de cellules GCaMP3 positives avec flux d’ions calcium pour un champ de puissance élevé a été augmenté dans le groupe traité par un milieu IMAP. Les NCF doivent être fraîchement préparés et en bonne santé après l’isolement.
Une procédure rapide d’isolement cardiaque, de coupure et de temps de digestion approprié peut aider à éviter une réduction de la viabilité et de l’état cellulaires. Cette méthode fournit un moyen d’identifier les ICM fonctionnels matures pour les chercheurs en reprogrammation cardiaque. Avec plusieurs autres méthodes d’évaluation, on peut obtenir une compréhension plus concise des ICM fonctionnels matures.
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Aperçu
Cet article présente une nouvelle lignée de souris rapporteuses, αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, destinée à l'évaluation de la reprogrammation cardiaque. Le protocole établi permet d'analyser les cardiomyocytes induits (iCMs) dérivés de fibroblastes cardiaques néonatals (NCFs) par l'analyse du flux calcique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Reprogrammation cardiaque
- Cardiomyocytes induits
- Analyse du flux calcique
Contexte
- Le modèle murin αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 facilite la recherche cardiaque.
- Les fibroblastes cardiaques néonatals peuvent être convertis efficacement en iCMs.
- Le flux calcique constitue un indicateur clé de la maturation fonctionnelle des iCMs.
- Cette méthode améliore la reproductibilité des études sur le reprogrammation cardiaque.
Objectif de l'étude
- Établir une plateforme fiable pour évaluer la maturation fonctionnelle des CMi.
- Simplifier les procédures d'évaluation dans la recherche sur la reprogrammation cardiaque.
- Fournir des informations sur la différenciation des cardiomyocytes et la fonction cardiaque.
Méthodes utilisées
- Isolation de fibroblastes cardiaques néonatals à partir de souriceaux âgés de P0 à P2.
- Conversion des fibroblastes cardiaques néonatals en cardiomyocytes induits.
- Évaluation de la maturation fonctionnelle par mesure du flux calcique.
- Analyse de l'efficacité de la reprogrammation et de la fonction cardiaque.
Résultats principaux
- Conversion réussie des NCF en iCM fonctionnels.
- Le flux de calcium observé exclusivement dans les iCM indique une maturation.
- Reproductibilité améliorée des résultats dans les études de reprogrammation cardiaque.
- Protocole applicable à l'évaluation de la différenciation des cardiomyocytes.
Conclusions
- Le modèle murin αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 est un outil précieux.
- L'analyse du flux de calcium est efficace pour évaluer la maturation des iCM.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en reprogrammation cardiaque et en fonction cardiaque.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation de la maturation fonctionnelle des cardiomyocytes induits demeure un goulot d'étranglement critique dans la reprogrammation cardiaque destinée aux thérapies régénératives. Ce protocole fournit une mesure directe, basée sur un marqueur rapporteur, du flux calcique, permettant une évaluation objective de la maturité fonctionnelle des CMi, et soutient la validation des cibles ainsi que la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. En reliant la reprogrammation transcriptionnelle à la sortie électrophysiologique fonctionnelle, il améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques et éclaire les décisions stratégiques concernant les approches de réparation cardiaque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en associant la livraison de facteurs de transcription (MGT) à des lectures fonctionnelles de transitoires calciques dans les cellules reprogrammées.
- Valeur opérationnelle : Utilise la fluorescence de GCaMP3 pour isoler les iCM correctement reprogrammés, réduisant ainsi la dépendance aux marqueurs indirects tels que l'expression génique.
- Valeur prédictive : Le flux calcique constitue un biomarqueur fonctionnel qui soutient la détection précoce des risques biologiques et renforce la confiance dans les cibles des approches de reprogrammation cardiaque.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Met en place une plateforme standardisée fondée sur la fluorescence pour quantifier le flux calcique comme variable dépendante quantitative dans les tests de maturation des CMi.
- Reproductibilité : La lignée de souris rapporteuse garantit une détection cohérente des CMi fonctionnels d’une expérience à l’autre, favorisant la standardisation des tests.
- Extensibilité : Compatible avec la microscopie à fluorescence et adaptable à des systèmes d’imagerie à haut débit pour l’analyse de l’efficacité de la reprogrammation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Fournit un système pertinent pour la maladie afin d'évaluer la maturation fonctionnelle des iCM in vitro, assurant ainsi un lien entre la découverte et la validation préclinique.
- Continuité translationnelle : Permet une évaluation longitudinale de la maturation des iCM, depuis les premiers stades de reprogrammation jusqu'à l'acquisition d'une compétence électrophysiologique fonctionnelle.
- Réduction des risques mécanistiques : Les mesures du flux calcique aident à distinguer les cellules reprogrammées sur le plan structurel des iCM fonctionnellement matures, réduisant ainsi les résultats faussement positifs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs et à l'évaluation préclinique, permettant spécifiquement une évaluation fonctionnelle après le reprogrammation transcriptionnelle mais avant la validation in vivo.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en déterminant si les facteurs de reprogrammation induisent non seulement l'expression de marqueurs, mais aussi une gestion fonctionnelle du calcium.
- Écrans (Screening) : Fournit des systèmes biologiques prêts à l'essai et reproductibles, avec des mesures quantitatives du flux calcique permettant la comparaison de composés ou de conditions.
- Analytique : Génère des données temporelles basées sur la fluorescence concernant la fréquence et l'amplitude des oscillations calciques, permettant des comparaisons statistiques des conditions de reprogrammation.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats de reprogrammation in vitro à des phénotypes fonctionnels de cardiomyocytes pertinents pour les modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme rapporteur réutilisable, applicable à plusieurs cibles de reprogrammation cardiaque et protocoles de différenciation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une mesure directe de la maturation fonctionnelle, réduisant l'ambiguïté mécanistique des résultats de reprogrammation.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité grâce à la spécificité des marqueurs génétiques, en minimisant la variabilité associée aux méthodes basées sur les anticorps.
- Valeur stratégique : Affine les décisions d'avancement ou d'abandon en reliant la reprogrammation moléculaire à la préparation fonctionnelle électrophysiologique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des stratégies de reprogrammation selon le rendement fonctionnel en iCM et la qualité de maturation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en élevage de souris, en isolement de tissu cardiaque et en microscopie à fluorescence.
- Dépend de l'accès à la lignée de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 et aux systèmes de délivrance virale pour la MGT.
- Exige des conditions et des délais de culture standardisés pour une induction reproductible des iCM et une évaluation fiable des flux calciques.
- Une adaptation à d'autres sources de fibroblastes ou à d'autres espèces peut nécessiter une validation de la spécificité du marqueur rapporteur et de la fidélité du signal calcique.
- Les limites pratiques incluent la dépendance à la contraction spontanée pour la visualisation des flux et la variabilité potentielle de l'efficacité de transfection.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
