Name: Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Apprenez la perfusion rétrograde de glande parotide chez un primate non humain pour l'administration de gènes vectoriels. Cette technique accessible permet la thérapie génique et la vaccination.

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Les auteurs tiennent à remercier M. Cagney Gentry pour son soutien audiovisuel dans le tournage de la procédure. Nous tenons également à remercier le centre médical Hefner VA pour son soutien académique dans la poursuite de ce projet.

Toutes les procédures ont été effectuées à la Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus pour des études animales. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) a été consulté pour des considérations éthiques et les détails des procédures ont été soumis pour examen. Wake Forest IACUC a approuvé notre protocole d’étude et toutes les procédures ont été effectuées en vertu du protocole approuvé par l’IACUC #A17-147.
1. Préparation du dispositif de perfusion
<ol><li>Coupez le tube en polyéthylène de taille 10 (PET10) en longueurs de 25 cm à l’aide d’une paire de ciseaux.</li>
	<li>Marquez PET10 à 1 cm et 2 cm d’une extrémité à l’aide d’un marqueur noir.</li>
	<li>Préremplir 0,5 mL de solution Ad5-EGFP (109 particules virales/mL) dans une seringue de 1 mL (tuberculine).</li>
	<li>Faire glisser l’extrémité non marquée du tube PET10 sur une aiguille de 29-31 G attachée à une seringue. Il est généralement plus facile d’effectuer cette tâche sous grossissement.</li>
	<li>Infuser la solution dans le PET10 jusqu’à ce que le tube soit complètement plein (goutte visible à l’extrémité libre).</li>
	<li>Utilisez un EPI standard complet, y compris des gommages chirurgicaux, une blouse à manches longues, des gants imperméables, un masque chirurgical, un écran facial, un bonnet de cheveux et des couvre-chaussures.</li>
</ol>2. Préparation de l’animal
REMARQUE: Les macaques Cynomolgus ont été utilisés pour la démonstration vidéo. L’anatomie d’autres primates non humains et humains est très similaire, et le protocole devrait être traduisible à d’autres espèces.
<ol><li>Injecter par voie sous-cutanée 0,05 mg/kg d’atropine 15 min avant la procédure afin de minimiser les sécrétions salivaires et d’optimiser la distribution et la rétention de l’infusate.</li>
	<li>Fournir une anesthésie à l’aide de seringues de 5 mL avec de la kétamine/midazolam intramusculaire (10-15 mg/kg de kétamine et 0,01-0,05 mg/kg de midazolam). Confirmez une anesthésie appropriée lorsque l’animal sous sédated devient inconscient et est incapable de réagir aux stimuli.</li>
</ol>3. Exécution de la procédure
<ol><li>Utilisez des rétracteurs oraux pour ouvrir la bouche.<ol>
<li>Placez le tampon en caoutchouc d’une extrémité de l’enrouleur sur le palais dur derrière les dents supérieures du côté de la bouche opposé à la glande qui sera infusée. Placez le tampon en caoutchouc de l’autre extrémité sur la canine inférieure du même côté que le rétracteur supérieur. Laissez doucement l’action du ressort de l’enrouleur se dilater et ouvrir la bouche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifiez la papille parotide, l’ouverture du canal de Stensen, sur la joue postérieure, adjacente à la 2e molaire supérieure. Ceci est mieux visualisé en utilisant des boucles dentaires pour le grossissement.</li>
	<li>Dilater doucement la papille parotide avec la pointe du dilatateur conique. Il est préférable de placer le point du dilatateur au centre ou à l’ouverture de la papille, puis de le faire pivoter doucement d’avant en arrière. Le point doit entrer lentement dans la papille et la dilater sur environ 20 à 30 s de rotation douce.</li>
	<li>Insérez le tube PET10 dans la papille parotide dilatée. Ceci est mieux réalisé en maintenant l’extrémité marquée du tube PET10 avec une pince à épiler à environ 0,5 cm de l’extrémité distale et en insérant doucement la pointe du tube dans la papille dilatée.<ol>
<li>Avancez doucement le tube, ce qui est souvent facilité par de petits mouvements de rotation pour aider le tube à glisser, suivis d’un réajustement de la pince à épile de 0,5 cm proximal à la poignée précédente. Répétez cette opération jusqu’à ce que la marque de 2 cm atteigne la papille parotide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquez du cyanoacrylate sur la joue autour de la papille et du tube inséré et attendez qu’il sèche (aucune quantité spécifique enregistrée, juste assez pour sceller l’entrée de la papille du canal de Stensen). Cela prend généralement moins d’une minute et aide à sceller la papille parotide et à réduire le déversement d’infusate dans la cavité buccale.</li>
	<li>Poussez lentement le contenu de la seringue sur 5 min à une vitesse de 100 μL/min. Ce débit de perfusion lent minimise le risque de lésion des conduits en raison de l’augmentation soudaine de la pression intra-canalaire.</li>
	<li>Laissez pet10 en place pendant au moins 5 minutes après la fin de la perfusion. Gardez le conduit scellé et laissez l’infusate rester dans la glande parotide.</li>
	<li>Retirez le PET10 avec une traction douce. Le cyanoacrylate se libérera avec le tube.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.2 à 3.8 du côté opposé.</li>
	<li>Libérez lentement les rétracteurs oraux après l’infusation des deux parotides et l’enlèvement des deux tubes en PET10. REMARQUE: L’ensemble de la procédure pour les deux côtés devrait prendre moins de 30 minutes.</li>
</ol>4. Soins post-procéduraux
<ol><li>Une fois la perfusion terminée et le canal de Stensen décannulé, observez les animaux jusqu’à ce que l’effet d’anesthésie s’estompe (généralement entre 20 et 30 minutes après la procédure).</li>
	<li>Offrez aux animaux des boissons, puis de la nourriture après qu’ils soient complètement éveillés et reprenez les soins de routine.</li>
</ol>

<ol><li>Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretion+of+mammalian+digestive+enzymes+by+exocrine+glands%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands.</a> The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).</li>
<li>Perez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+epithelial+cells%3A+An+unassuming+target+site+for+gene+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).</li>
<li>Kochel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dengue+virus+serotype-1+DNA+vaccine+induces+virus+neutralizing+antibodies+and+provides+protection+from+viral+challenge+in+Aotus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys.</a> Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).</li>
<li>Ponzio, T. A., Sanders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+gland+as+a+target+for+enhancing+immunization+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Diseases%2C+Travel+Medicine+and+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The salivary gland as a target for enhancing immunization response.</a> Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).</li>
<li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).</li>
<li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+Transgenic+Secretory+Proteins+in+Rhesus+Macaque+Parotid+Glands+After+Adenovirus-Mediated+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer.</a> Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).</li>
<li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+systemic+transgene+expression+after+nonviral+salivary+gland+transfection+using+a+novel+endonuclease+inhibitor%2FDNA+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation.</a> Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).</li>
<li>Niedzinski, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Enhancement+of+Nonviral+Salivary+Gland+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection.</a> Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).</li>
<li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+salivary+glands%3A+From+the+bench+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).</li>
<li>Voutetakis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype+2-Mediated+Gene+Transfer+to+The+Parotid+Glands+of+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole d’infusion rétrograde dans la glande parotide à travers le canal de Stensen. La méthodologie décrite offre des conseils qui peuvent potentiellement être utilisés par les chercheurs qui explorent l’utilité du tissu salivaire en tant que site pour la thérapie génique et d’autres applications.
Il existe plusieurs étapes critiques pour assurer le succès de la procédure. Tout d’abord, toutes les étapes de la procédure doivent être complétées en douceur. Un contrevent...

Alors que les glandes salivaires sont bien connues pour leur production exocrine de salive, les chercheurs ont depuis longtemps reconnu leur capacité à sécrétionner des protéines directement dans la circulation sanguine1,ce qui en fait une cible potentielle pour la thérapie génique pour l’administration systémique, comme les hormones de remplacement ou la production d’anticorps. En fait, les glandes salivaires offrent plusieurs avantages par rapport à d’autres cibles tissulaires, tels que la capacité inhérente à produire des protéines pour la sécrétion (une propriété qui manque aux muscles), une encapsulation lourde qui peut limiter la diffusion des vecteurs et des tissus bien différenciés assurant la stabilité des vecteurs non intégrateurs. De plus, en cas d’événement indésirable grave, les glandes salivaires ne sont pas critiques pour la vie et peuvent être enlevées chirurgicalement. Bien qu’elles ne soient pas immédiatement intuitives, les glandes parotides sont également facilement accessibles depuis la bouche par leur principal canal excréteur, le canal2de Stensen.
Compte tenu des avantages du tissu salivaire pour la thérapie génique, il y a un intérêt croissant pour l’exploration de cette cible tissulaire. De nombreuses études ont déjà été réalisées sur des modèles de primates rongeurs, canins et non humains et au moins un essai clinique humain est en cours3,4,5. Pour explorer et développer davantage l’utilité de cette cible tissulaire à des fins de thérapie génique, d’autres études sur les primates non humains devront être effectuées. Cet article décrit une méthode d’accès aux glandes parotides par le canal de Stensen pour délivrer un gène vectoriel de transduction dans le modèle de primate non humain. Pour démontrer visiblement l’administration de l’infusate et l’anatomie du canal lorsqu’il pénètre dans la glande, une fluoroscopie à l’aide d’un radiocontraste a été effectuée. Pour démontrer la transduction réussie d’un vecteur, un gène egfp vectoriel adénovirus de sérotype 5 (Ad5) a été utilisé. Ad5 est un vecteur bien décrit capable de transduire le tissu salivaire. Bien qu’il soit trop immunogène pour une utilisation clinique finale, un vecteur Ad5 a été choisi pour cette étude de démonstration afin d’assurer une transduction efficace. L’évaluation de la production de protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) est une méthode bien décrite pour démontrer la transcription et la traduction réussies d’un gène vectoriel après la transduction et a été réalisée ici.

<table><tbody><tr><td>500 et micro ; Seringues L U100 avec aiguilles de calibre 30</td><td>Becton Dickinson</td><td>328466</td><td>aiguille fixe pour moins de déchets</td></tr><tr><td>Adhésif (par exemple, Ethicon Dermabond)</td><td>Divers</td><td></td><td>adhésifs cyanoacrylate pour sceller et maintenir le tube dans le conduit pendant la perfusion.</td></tr><tr><td>Solution injectable d’atropine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07 869-6061</td><td>Atropine inj. 0,54 mg/mL</td></tr><tr><td>Seringues à insuline ultra-fines BD 30G</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td>Disponible en formats de 0,5 mL et 1,0 mL.</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate (colle médicale)</td><td>Ethicon</td><td>DNX12</td><td>Adhésif cutané topique Dermabond</td></tr><tr><td>Boucles dentaires avec lumière</td><td>Amazon (DDP)</td><td>B012M3IV80</td><td>Utilisé pour améliorer la visualisation de la papille du canal de Stensen</td></tr><tr><td>Dilatateur lacrymal infantile</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-137</td><td></td></tr><tr><td>Solution injectable de kétamine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637</td><td>Ketaset inj. 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Dilatateur lacrymal</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-132</td><td>Utilisé pour dialoguer le canal de Stensen.</td></tr><tr><td>Solution injectable de midazolam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07 890-6698</td><td>Midazolam inj. 5mg/mL</td></tr><tr><td>Paire de ciseaux</td><td>Amazon (DDP)</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour couper le tube PET10</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène (PE-10)</td><td>Scientific Comodities, Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Tube reliant la seringue 30G et inséré dans le conduit.</td></tr><tr><td>Q-tips</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour étaler du cyanoacrylate sur la joue</td></tr><tr><td>Taille 10 Tube en polyéthylène (PET 10)</td><td>Produits scientifiques</td><td>BB31695-PE/1</td><td>tube en polyéthylène basse densité</td></tr><tr><td>Ouvre-bouche pour petits animaux</td><td>Amazon (DDP</td> <td>B01F3LVJXC</td><td>Utilisé pour garder la bouche de l’animal ouverte.</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Amazon (DDP)</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour insérer le tube PET10 dans le conduit de Stenson</td></tr><tr><td>Chlorure de zinc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7646-86-7</td><td>Inclus dans les perfusions d’ADN plasmidique</td></tr></tbody></table>

perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Retrograde Parotid Gland Infusion through Stensen's Duct in a Non-Human Primate for Vectored Gene Delivery

Les glandes salivaires sont une cible tissulaire attrayante pour la thérapie génique avec des résultats prometteurs menant déjà à des essais sur l’homme. Ils sont intrinsèquement capables de sécrétion de protéines dans la circulation sanguine et sont facilement accessibles, ce qui en fait des sites tissulaires potentiellement supérieurs pour la production d’hormones de remplacement ou la vaccination par transfert de gènes. Les méthodes suggérées pour l’administration de gènes comprennent l’injection transcutanée et la perfusion rétrograde par les canaux salivaires. Nous démontrons comment effectuer une perfusion rétrograde de glandes salivaires (RSGI) chez des primates non humains. Nous décrivons les points de repère anatomiques importants, y compris l’identification de la papille parotide, une méthode atraumatique de canulation et de scellement du conduit de Stensen à l’aide d’outils dentaires de base, de tubes en polyéthylène et de cyanoacrylate, et le taux de perfusion approprié. Bien qu’il s’agisse de la méthode d’accouchement la moins traumatisante, la méthode est encore limitée par le volume pouvant être délivré (<0,5 mL) et le risque de traumatisme du canal et de la glande. Nous démontrons par fluoroscopie qu’un infusate peut être entièrement délivré dans la glande, et démontrons en outre par immunohistochimie la transduction d’un vecteur typique et l’expression du gène délivré.

Procédure, transduction et transcription réussies La figure 1 montre la papille parotide adjacente à la 2 e molaire sur la joue supérieurepostérieure. L’image montre également l’emplacement correct de l’attelle buccale, une extrémité en caoutchouc sur le palais dur et l’autre extrémité en caoutchouc sur la canine ipsilatérale. La figure 2 montre une image prise après une canulation réussie de la papille parotide à la marque de 2 cm...

Les glandes salivaires ont été proposées comme site cible tissulaire pour la thérapie génique, en particulier dans le domaine de la vaccination par transfert de gènes. Nous démontrons l’administration de gènes dans un modèle de primate non humain utilisant une perfusion parotide rétrograde.

Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

Salivary glands are an attractive tissue target for gene therapy with promising results already leading to human trials. They are inherently capable of ...

Ce protocole est important car il démontre en détail la procédure de perfusion rétrograde des glandes salivaires. La procédure peut être utilisée pour diverses raisons médicales, telles que l’immunoprophylaxie vectorielle ou la thérapie génique. Cette technique est facile à apprendre et à reproduire.Les auteurs ont réussi à effectuer cette procédure avec succès à plusieurs reprises en dépit de ne pas être des chirurgiens buccaux, ni d’avoir une telle expérience. Après anesthésie, utilisez des télescopes dentaires pour le grossissement et identifiez la papille parotide ou l’ouverture du canal de Stenson sur la joue postérieure adjacente à la deuxième molaire supérieure. Dilatez doucement la papille parotide en plaçant la pointe d’un dilatateur conique au centre ou à l’ouverture de la papille et faites pivoter le dilatateur d’avant en arrière pendant environ 20 à 30 secondes.Ensuite, à l’aide d’une pince à épileuse, maintenez l’extrémité marquée du tube en polyéthylène attachée à la seringue contenant de l’infuseur à environ 0,5 centimètre de l’extrémité distale et insérez doucement l’extrémité du tube dans la papille dilatée. Avancez doucement le tube par de petits mouvements de rot

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Perfusion rétrograde de glande parotide à travers le canal de Stensen chez un primate non humain pour l’administration de gènes vectoriels

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