Name: Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez un essai rAAV pour visualiser l'activité des amplificateurs dans le cerveau de souris. Cette méthode permet d'évaluer rapidement l'expression génique localisée et d'étudier les mécanismes de régulation neuronale.

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Le séquençage a été effectué à l’UC Davis DNA Technologies Core. Nous remercions le laboratoire de Lin Tian à UC Davis pour la formation sur l’emballage rAAV et pour nous avoir généreusement offert des plasmides d’aide AAV et de rep/capuchon. Ce travail a été soutenu par NIH/NIGMS R35GM119831.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ce protocole décrit une méthode basée sur rAAV pour le déploiement de transgènes pilotés par amplificateur dans le cerveau postnatal de la souris. Dans ce protocole généralisé, un amplificateur candidat, un promoteur minimal, un gène rapporteur et une séquence de codes-barres optionnelle sont clonés dans un squelette plasmidique AAV. Ces expériences peuvent être réalisées avec une seule séquence d’amplificateur candidat ou avec plusieurs séquences en parallèle. Le plasmide est emballé dans un rAAV et livré au cerveau pos...

Les amplificateurs sont des éléments cis-régulateurs génomiques qui servent de sites de liaison au facteur de transcription et peuvent conduire l’expression d’un gène cible d’une manière spatio-temporellement spécifique 1,2. Ils sont différentiellement actifs dans différents types de cellules, tissus et stades de développement et peuvent être des substrats de variation génomique liée au risque de maladie 3,4. Ainsi, la nécessité de comprendre la dynamique de la fonction de l’amplificateur est essentielle pour progresser dans les applications scientifiques translationnelles et fondamentales en génomique. Les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur peuvent constituer d’excellentes ressources pour générer des hypothèses quant à la capacité de l’amplificateur 5,6. Une telle activité d’amplificateur prévue peut nécessiter une validation et une interrogation supplémentaires pour une compréhension complète de l’activité fonctionnelle. Les tests de rapporteurs Enhancer se sont révélés utiles à cette fin dans une variété de systèmes, des cellules aux animaux 7,8,9. Afin d’étendre ces études dans un contexte transitoire in vivo flexible et rentable, ce protocole décrit l’utilisation de méthodes in vivo basées sur l’AAV pour tester des séquences d’amplificateurs putatifs pour leur capacité à conduire l’expression d’un gène rapporteur ectopique dans le cerveau postnatal de la souris. Cette famille de méthodes est utile pour interroger des séquences candidates uniques ou un criblage parallèle en bibliothèque et est pertinente pour la recherche fondamentale et translationnelle.
Cette méthode combine dans un seul plasmide une séquence d’ADN candidate amplificateur putative avec un gène rapporteur (ici EGFP), sous le contrôle d’un promoteur minimal qui seul ne conduit pas à une expression significative. Le plasmide est emballé dans un AAV recombinant (rAAV) et injecté dans un modèle animal. Bien que l’application ici soit au cerveau, divers sérotypes rAAV permettent l’infection à travers différents types de tissus afin que cette approche puisse être étendue à d’autres systèmes10. Après un certain temps, le cerveau peut être recueilli et analysé pour l’expression du gène rapporteur. Une forte expression, comparée à celle des témoins, indique que la séquence candidate testée a pu « améliorer » l’expression du gène (Figure 1). Cette conception simple offre une approche simple et claire pour tester une séquence d’activité d’amplificateur in vivo dans le cerveau.
En plus de tester la capacité d’amplificateur d’une séquence, cette méthode peut être combinée avec des techniques pour déterminer l’activité de l’amplificateur de type cellulaire. Dans les approches basées sur la séquence pour déterminer l’activité différentielle de l’amplificateur, le tri des cellules sur des marqueurs spécifiques au type cellulaire avant le séquençage de l’ADN et de l’ARN peut permettre aux chercheurs de déterminer si différents types de cellules montrent une activité d’amplificateur différentiel, comme cela a été décrit dans Gisselbrecht et coll.11. Dans les approches basées sur l’imagerie, le comarquage d’images avec des marqueurs spécifiques au type cellulaire permet d’examiner si les cellules présentant une fluorescence enhancer-driven présentent également des marqueurs de type cellulaire d’intérêt 12,13,14,15,16. Les tests de rapporteur d’amplificateur permettent de tester directement la variation allélique associée au risque dans les amplificateurs pour les effets sur la capacité de l’amplificateur. La grande majorité des loci de risque identifiés dans les études d’association pangénomique (GWAS) se trouvent dans des régions non codantes du génome17. Les études d’annotation fonctionnelle de ces loci de risque indiquent qu’une grande partie agit probablement comme amplificateurs18,19,20. Le déploiement de la MPRA in vivo peut permettre de tester ces variantes associées au risque pour l’activité d’amplificateur dans le cerveau12,21. Enfin, la livraison et la collecte à différents moments peuvent donner un aperçu des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif.
Les conceptions de plasmides amplificateurs-rapporteurs sont diverses et peuvent être personnalisées pour répondre aux objectifs expérimentaux. Il existe plusieurs options pour les promoteurs minimaux qui ont été utilisées dans la recherche sur les amplificateurs, telles que le promoteur minimal de la β-globinehumaine 22 et le promoteur minimal Hsp6823 de souris. Ces promoteurs sont connus pour conduire de faibles niveaux d’expression à moins qu’ils ne soient couplés à un élément amplificateur pour les activer. En revanche, les éléments promoteurs constitutifs entraînent une forte expression du transgène, utile pour le contrôle positif ou pour tester la fonction d’amplificateur dans un contexte d’expression robuste. Les choix courants pour les promoteurs constitutifs comprennent CAG, un promoteur hybride dérivé du promoteur de la β-actine de poulet et de l’amplificateur immédiat-précoce du cytomégalovirus24, ou EF1α25 humain. Étant donné que les amplificateurs sont connus pour fonctionner de manière bidirectionnelle26, l’orientation et l’emplacement de l’amplificateur par rapport au promoteur minimal sont flexibles (Figure 2A). Les tests traditionnels d’amplificateur-rapporteur placent l’amplificateur en amont du promoteur et, dans les livraisons en bibliothèque, incluent une séquence de codes-barres en aval du gène rapporteur pour associer les lectures de séquençage à l’amplificateurtesté 27. Cependant, les amplificateurs peuvent également être placés dans le cadre de lecture ouvert du gène rapporteur et servir de séquence de codes à barres, comme cela se fait dans STARR-seq28. Le protocole décrit ici utilise la conception du test STARR-seq, plaçant la séquence d’amplificateur candidat dans l’UTR 3' du gène rapporteur. Bien que l’orientation STARR-seq offre l’avantage d’un clonage plus rationalisé, elle est moins bien comprise que l’approche conventionnelle et peut induire une stabilité variable de l’ARN entre les constructions. Les méthodes décrites peuvent être facilement adaptées à l’orientation STARR-seq ou conventionnelle avec des modifications mineures au processus de clonage qui ont été décrites ailleurs27,29.
Différentes méthodes d’administration d’AAV peuvent être utilisées pour personnaliser davantage cette technique afin qu’elle corresponde aux objectifs expérimentaux (Figure 2B). Les injections intracrâniennes directes, décrites plus loin dans ce protocole, délivrent une forte concentration de virus directement dans le cerveau30. Cela donne une efficacité de transduction élevée centrée sur le site d’injection, ce qui en fait une excellente technique pour les expériences cherchant à maximiser la densité des cellules transduites sur une zone de tissu. L’injection stéréotaxique peut aider à normaliser le site d’injection chez les animaux pour une transduction localisée reproductible. Les injections intracrâniennes sont plus simples chez les animaux postnataux précoces. Comme technique alternative, les injections systémiques peuvent délivrer des transgènes en utilisant des AAV avec des sérotypes capables de traverser la barrière hémato-encéphalique31. Les injections de veines de queue permettent au virus de circuler dans tout le corps, permettant une administration généralisée dans de nombreux tissus10. Les injections rétro-orbitales sont une autre technique d’injection systémique qui délivre le virus derrière l’œil dans le sinus rétro-orbitaire32. Cela offre une voie plus directe pour l’AAV du système veineux au cerveau, ce qui entraîne une concentration plus élevée de cellules transduites dans le cerveau que les injections dans des vaisseaux sanguins plus périphériques33.
Un autre aspect flexible de cette technique est la méthode de lecture. De façon générale, les options peuvent être décrites comme étant fondées sur le déclarant ou le séquençage (figure 2C). L’incorporation d’un rapporteur fluorescent tel que GFP dans le cadre de lecture ouvert de la construction entraîne l’expression de la protéine fluorescente dans toutes les cellules transduites où l’amplificateur candidat a entraîné l’expression. Les techniques de marquage et d’imagerie telles que l’immunohistochimie permettent l’amplification du signal. Les techniques de lecture basées sur le séquençage impliquent l’identification de séquences de la construction délivrée dans l’ARN prélevé dans le tissu. En quantifiant la quantité d’ADN viral initialement délivrée, la comparaison de l’ARN exprimé par rapport à l’ADN délivré peut être utilisée pour déterminer dans quelle mesure une séquence d’amplificateur testée était capable de conduire à une expression accrue du transgène, par exemple, dans le contexte d’un test de rapporteur massivement parallèle (MPRA). Les MPRA offrent une puissante expansion de ces techniques pour tester simultanément jusqu’à des milliers d’amplificateurs candidats et ont été largement décrits dans la recherche en génomique 12,27,34,35,36. Un criblage à débit plus élevé est obtenu en exécutant des étapes de clonage, d’empaquetage, de livraison et de séquençage pour les améliorateurs candidats par lots plutôt qu’individuellement.
La sélection d’un candidat amplificateur offre une autre possibilité de flexibilité (Figure 2D). Par exemple, ce test peut être utilisé pour identifier les amplificateurs d’un gène spécifique, pour déterminer la fonction des régions d’intérêt de l’ADN non codantes, ou pour déterminer des types de cellules spécifiques ou des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif - qui servent tous des objectifs à la fois en science fondamentale et en recherche sur les maladies. En général, la sélection des amplificateurs candidats est motivée par les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur. Généralement, les prédictions in silico incluent ChIP-seq pour les modifications des histones qui indiquent des amplificateurs probables, tels que H3K27ac37 et la cartographie de l’accessibilité de la chromatine38. Enfin, un domaine de recherche croissant est le criblage basé sur la fonction d’éléments amplificateurs synthétiques, permettant des études sur la façon dont la séquence d’amplificateurs dirige la fonction39 et la conception d’amplificateurs ayant des propriétés spécifiques40.

<table><tbody><tr><td>10x Tampon de citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A : Amorce Forward conçue sur mesure</td><td>pour la vérification des clones après transformation. Ces amorces sont spécifiques au vecteur utilisé et ont été conçues pour le vecteur spécifique utilisé dans nos expériences.</td></tr><tr><td>5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A :</td><td>Amorce inversée conçue sur mesure pour la vérification des clones après transformation. Ces amorces sont spécifiques au vecteur utilisé et ont été conçues pour le vecteur spécifique utilisé dans nos expériences.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>VWRVN605-500G</td><td></td></tr><tr><td>Assemblages de tubes d’aspirateur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td>pour l’administration par voie orale de rAAV</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri bactériologiques</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chicken IgY anti-GFP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Les images ont été prises sur le modèle LSM800, mais Zeiss a lancé le modèle LSM900 ces dernières années pour remplacer le LSM800.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Cryomoules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9806558</td><td>Ces moules sont adaptés au cerveau de souris P28. D’autres tailles peuvent être plus appropriées pour des tissus plus grands ou plus petits.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection, 4.5"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-poulet AlexaFlour-488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s PBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifugeuses tubes 2.0 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>22431048</tr><tr><td>Falcon tubes à fond rond 14 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Colorant vert rapide</td><td>Grainger</td><td>F0099-1G</td><td></td></tr><tr><td>Set de pinceaux à détails fins</td><td>Artbrush Tower</td><td>B014GWCLFO</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S Tubes capillaires</td><td></td></tr><tr><td>en verre</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12663</td><td>Kit de préparation maxi de plasmide commercial</td></tr><tr><td>HyClone HyPure Molecular Biology Grade Eau</td><td>VWR</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>IV Set de perfusion papillon avec tube 12" et aiguille 25G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>Lingette non pelucheuse</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>LB Prémélange de gélose pour milieux sélectifs</td></tr><tr><td>McPherson Vannas ciseaux à iris</td><td>Integra LifeSciences</td><td>360-215</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma Life Science</td><td>69794-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stable Competent E. coli</td><td>NEB</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et nettoyage PCR</td><td>Takara</td><td>740609.5</td><td>Kit pour réaction enzymatique nettoyage et extraction de gel</td></tr><tr><td>OCT moyen</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>Cole Parmer</td><td>60-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II ADN polymérase haute fidélité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>Lait en poudre</td><td>Sunny Select</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purification PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Tampon</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Tampon pour la digestion de restriction avec PacI, AscI et XmaI</td></tr><tr><td>Enzyme de restriction : AscI</td><td>NEB</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction : PacI</td><td>NEB</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction : XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance SOC</td><td>NEB</td><td>B0920S</td><td>Milieu de récupération après transformation</td></tr><tr><td>Saccharose ( RNase/DNase free)</td><td>Millipore Sigma</td><td>033522.5KG</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Apex</td><td>20-194</td><td></td></tr><tr><td>Tubulure de transfert</td><td>Gilson</td><td>F1179941</td><td>Pour pompe péristaltique</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Système de purification d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1460</td><td>Plasmid mini prep kit</td></tr></tbody></table>

déploiement aav de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Les amplificateurs sont des plates-formes de liaison pour un large éventail de facteurs de transcription qui conduisent à des modèles d’expression spécifiques de gènes spécifiques aux tissus et aux types cellulaires. De multiples moyens d’évaluer l’ADN non codant et divers états de chromatine se sont révélés utiles pour prédire la présence de séquences d’amplificateurs dans le génome, mais valider l’activité de ces séquences et trouver les organes et les stades de développement dans lesquels elles sont actives est un processus à forte intensité de main-d’œuvre. Les progrès récents dans les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) ont permis la livraison généralisée de transgènes aux tissus de souris, permettant des tests d’amplificateur in vivo sans nécessiter un animal transgénique. Ce protocole montre comment une construction rapporteur qui exprime l’EGFP sous le contrôle d’un promoteur minimal, qui ne conduit pas d’expression significative par elle-même, peut être utilisée pour étudier les modèles d’activité des séquences d’amplificateurs candidats dans le cerveau de la souris. Une construction de rapporteur emballée AAV est livrée au cerveau de la souris et incubée pendant 1 à 4 semaines, après quoi l’animal est sacrifié et des sections de cerveau sont observées au microscope. L’EGFP apparaît dans les cellules dans lesquelles l’amplificateur testé est suffisant pour initier l’expression génique, en localisant l’emplacement et le stade de développement dans lequel l’amplificateur est actif dans le cerveau. Les méthodes de clonage standard, l’emballage AAV à faible coût, les sérotypes AAV en expansion et les méthodes d’administration in vivo et de lecture d’imagerie standard en font une approche accessible pour l’étude de la régulation de l’expression génique dans le cerveau.

En utilisant ces méthodes, une séquence de 915 pb dans le troisième intron associé au risque psychiatrique du gène CACNA1C19,49,50 a été testée pour l’activité d’amplificateur dans le cerveau postnatal de la souris. Cette séquence a été découverte dans un MPRA de 345 séquences d’amplificateurs candidats centrées sur les SNP de risque psychiatrique et neurologique12 et les expériences de caractéri...

Ce protocole décrit un nouveau test d’amplificateur-rapporteur transitoire basé sur le rAAV. Ce test peut être utilisé pour induire une expression pilotée par l’amplificateur in vivo dans le cerveau de la souris.

Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Ce protocole est important car il permet de visualiser non seulement si une séquence d’amplificateur peut conduire l’expression, mais aussi où elle peut conduire l’expression dans une partie particulière du corps. C’est rapide. Les injections prennent moins de 10 minutes, et si et où un gène rapporteur est exprimé peut être vu dans les quelques jours seulement suivant le prélèvement de l’échantillon.Pour commencer le clonage, choisissez ou concevez une construction de rapporteur. La construction utilisée ici place le candidat amplificateur dans les trois régions premières non traduites d’un gène rapporteur EGFP exprimé sous le contrôle du promoteur minimal hsp68. Pour concevoir les amorces de PCR permettant d’amplifier une séquence d’intérêt et de cloner dans le vecteur, ajoutez le bras d’homologie approprié pour le clonage de Gibson à l’extrémité première des amorces.À l’aide des amorces conçues, effectuez une PCR à partir d’un échantillon d’ADN. Digérer un à 10 microgrammes d’ADN vectoriel en utilisant Pac1 et Asc1, selon le nombre souhaité de réactions de clonage requises. En utilisant une électrophorèse sur gel de 0,7 à 1% pendant 30 à 60 minutes à 100 volts, séparez les fragments de condensation de restriction.Extrayez la bande pour le vecteur linéarisé et purifiez-la avec un kit d’extraction de gel commercial. Une fois le clonage de Gibson et la transformation des cellules terminés, plaquez les cellules sur des milieux sélectifs et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir vérifié le clonage réussi de la construction du rapporteur, inoculer cinq millilitres de la culture de démarrage en utilisant le stock de glycérol.Cultivez la culture pendant huit à 16 heures dans un incubateur à secousses à 30 degrés Celsius et 180 rotations par minute. Lorsque le bouillon devient trouble, diluez la culture de démarrage 1 000x dans 250 à 300 millilitres de bouillon LB sélectif frais et incuberez-la pendant la nuit dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius et 180 rotations par minute. À l’aide d’un kit maxi plasmidique commercial, purifiez le plasmide.Pour tester la recombinaison des RTI, effectuez une digestion Xma1. Visualisez les bandes. Assurez-vous que votre résumé indique le nombre de bandes attendu.La recombinaison se traduira par moins de bandes que prévu. Préparer le mélange AAV recombinant pour l’administration. Si vous comparez les profils d’expression de plusieurs virus rapporteurs amplificateurs, diluez chaque virus pour assimiler les titres de virus au virus le moins concentré.Mélanger le virus rapporteur amplificateur et le virus rapporteur de contrôle exprimé de manière constitutive dans un rapport de deux à un ou de trois à un. Ajouter une petite quantité de colorant vert rapide avec une concentration finale de 0,06%Casser l’embout d’une pipette en verre tiré fabriquée à partir d’un tube capillaire gradué d’un microlitre en le perçant doucement dans une lingette délicate non pelucheuse. Insérez la pipette dans un ensemble d’aspiration à l’aide d’un dispositif d’application de pression relié à un joint en caoutchouc pour maintenir une pipette microcapillaire.Aspirez un petit volume d’environ 0,2 à 0,5 microlitre d’huile minérale dans la pipette en appliquant une pression négative à travers l’aspirateur. Gardez l’appareil d’aspiration de côté et placez le virus sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être injecté. Après avoir cryo-anesthésié les souris néonatales, appliquez une pression négative à l’aide de l’ensemble aspirateur et aspirez le mélange de virus dans la pipette en verre tiré jusqu’à ce que le ménisque dépasse la marque de deux microlitres.Éloignez la souris de la chambre froide et placez-la sur le plan de travail. Situez les sites d’injection bilatérale à mi-chemin entre le lambda et le bregma, ainsi que la suture sagittale et chaque œil. Désinfectez-les à l’aide d’une lingette alcoolisée.Percez le crâne des souris néonatales à l’aide de la pipette en verre tiré. Lorsque l’aiguille pénètre dans le crâne, appliquez une pression positive à travers l’aspirateur. Distribuez un microlitre du virus dans le ventricule latéral et retirez la pipette.Placez la souris sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante pour récupérer. Remettez l’animal dans la cage familiale une fois réveillé. Enregistrez des images de fluorescence traversant la section du cerveau à l’aide d’une lentille subjective 5x à faible grossissement.En localisant le site d’injection, évaluer l’étendue de la transduction du virus, en fonction de la densité et de l’intensité des cellules fluorescentes rouges. Comparez les animaux qui ont été transduits de la même manière. Enregistrez des images fluorescentes avec un objectif de grossissement plus élevé de plus de 25x.Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse et appliquez un filtre médian trois par trois pour réduire le bruit. Cliquez sur le menu Processus, puis cliquez sur Bruit, et choisissez l’option Despeckle. Ensuite, pour soustraire la fluorescence d’arrière-plan des images, commencez par séparer les canaux d’une image multicouche.Cliquez sur le menu Image, puis sur Couleur, et sélectionnez l’option Diviser les canaux. À l’aide de l’outil de sélection de rectangle ou de cercle, dessinez une petite forme dans une zone de l’image sans cellules fluorescentes. Mesurez l’intensité moyenne en pixels de l’arrière-plan en cliquant sur Analyser, puis sur Mesurer, et répétez l’opération pour échantillonner plusieurs fois.Faites la moyenne de la valeur moyenne des gris de cinq à huit zones d’arrière-plan et laissez tomber les valeurs décimales. Soustrayez les valeurs de chaque pixel de l’image en sélectionnant le menu Processus, puis cliquez sur Mathématiques et soustraire. Ensuite, entrez la valeur d’arrière-plan à soustraire, puis cliquez sur OK. Si nécessaire, fusionnez les canaux en une image multicanal en sélectionnant le menu Image, puis cliquez sur Couleur, puis sélectionnez Fusionner les canaux.Pour compter le nombre de cellules fluorescentes vertes, masquez le canal vert et dessinez une forme autour de la région du cerveau exprimant la fluorescence rouge à l’aide de l’outil de sélection de forme libre. Cliquez sur la fonction Mesure pour mesurer la surface, la densité intégrée et la valeur de gris moyenne du canal rouge dans la zone sélectionnée. Comptez le nombre de cellules vertes à l’aide d’un outil de sélection multipoint et normalisez le nombre de cellules vertes par l’intensité intégrée du canal rouge.Après avoir transduit le rapporteur amplificateur que la souris injectait par voie intracrânienne à P0 avec une construction AAV positive a montré une expression EGFP enhancer-driven dans les couches inférieures moyennes du cortex 28 jours après l’injection. La souris injectée avec une construction de contrôle négatif à P0 ne montre aucune expression de l’EGFP 28 jours après l’injection, démontrant que les éléments amplificateurs sont trouvés pour conduire la transcription de l’EGFP dans le cerveau de la souris. Pour visualiser la zone transduite avec succès et contrôler la variabilité potentielle, des bibliothèques de rapporteurs d’amplificateur AAV de différents titres ont été examinées.La bibliothèque de titres élevés des amplificateurs candidats entraîne une large expression EGFP tandis que la bibliothèque de titres inférieurs des amplificateurs candidats entraîne une expression clairsemée de CGFP dans le cerveau de souris P7. Il est essentiel de mélanger le reporter amplificateur AAV avec le contrôle positif à chaque injection afin de faire la distinction entre les amplificateurs sans activité et les accouchements échoués. Cette procédure peut être associée à l’immunohistochimie, à l’ARN FISH ou au séquençage de l’ARN unicellulaire pour déterminer les types de cellules dans lesquels un amplificateur est actif.

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