Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Les macrophages associés aux tumeurs anti-inflammatoires sont liés à la progression et au mauvais pronostic du cancer. Ce protocole est un guide pour différencier et polariser les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Actuellement, il n’existe pas de modèle établi pour la polarisation anti-inflammatoire du THP-1.

Ce protocole utilise des périodes de repos adéquates et un processus de polarisation prolongé pour créer un sous-type de macrophage distinct de type M2. Le développement tumoral, par exemple, dans le cancer du côlon et le remodelage des tissus, sont contrôlés par des macrophages anti-inflammatoires. Parmi les études portant sur leur fonction, la création standardisée d’un sous-type distinct de type M2 garantit des résultats reproductibles.

Commencez par régler une minuterie pendant 150 secondes. Retirez le flacon congelé contenant la lignée cellulaire THP-1 de l’azote liquide et décongelez le flacon immédiatement à 37 degrés Celsius dans un bain-marie propre, en démarrant la minuterie dès que le flacon est mis dans le bain-marie. Desserrer le bouchon pour libérer la pression accumulée en raison du processus de décongélation, en veillant à ce que l’ouverture du tube n’entre pas en contact avec l’eau pour éviter toute contamination.

Décongelez la suspension de la cellule jusqu’à ce qu’une puce de glace d’environ quatre millimètres soit laissée dans le flacon et passez immédiatement à l’étape suivante. Transférer la phase liquide de la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant neuf millilitres de milieux de croissance chauds. Ensuite, transférez un millilitre de cette suspension de cellules moyennes chaudes dans le flacon THP-1 et retournez dans le tube de 15 millilitres pour faire fondre la puce de glace restante, et rincez le flacon pour vous assurer qu’aucune cellule n’est laissée derrière.

Mélangez doucement la suspension en la pipetant de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Retirez environ 10 microlitres de l’échantillon pour compter la viabilité des cellules à l’aide du bleu de trypan. Les cellules avec un cytoplasme clair sont viables, un cytoplasme bleu indique la mort cellulaire.

Pendant le comptage, faites tourner la suspension de la cellule chaude à 200 fois G pendant sept minutes à 37 degrés Celsius. Retirez complètement le surnageant et ressuspendez les cellules dans le milieu de croissance pour atteindre une densité cellulaire de 500 000 cellules par millilitre. Mélanger doucement la suspension et transférer 22 millilitres dans des flacons de culture cellulaire T75 chacun.

Conservez les flacons à la verticale dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec une concentration de dioxyde de carbone de 5% et échangez le milieu de croissance tous les trois à quatre jours. Préparer la suspension cellulaire pour ensemencer les cellules à une densité de 300 000 par millilitre par puits dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits. Mélanger doucement le milieu et préparer des aliquotes de 26 millilitres dans des tubes de 50 millilitres.

Transférer un millilitre du milieu contenant la cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Mélangez doucement le média en le pipetant de haut en bas entre les transferts. Conservez la solution de travail de PMA fraîchement préparée sur de la glace et ajoutez 100 nanogrammes de PMA par puits.

Incuber les plaques dans l’incubateur sans autre traitement pendant 72 heures. Après 72 heures, retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais, en veillant à ne pas toucher le fond des puits avec des pointes de pipette. Laissez les cellules reposer pendant encore 96 heures dans l’incubateur.

Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais. Ajouter 20 nanogrammes d’interleukine 4 et 20 nanogrammes d’interleukine 13 par puits. Laissez ensuite les cellules reposer pendant 48 heures dans l’incubateur.

Répétez tout le processus après 48 heures et laissez les cellules reposer pendant encore 48 heures dans l’incubateur. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par un millilitre de milieu de croissance frais. Laissez ensuite les cellules reposer pendant 48 heures dans l’incubateur.

Retirez le milieu cellulaire chaud de chaque puits et remplacez-le par un mélange d’un millilitre de PBS glacé sans calcium et magnésium et 5% FBS. Ensuite, placez immédiatement la plaque cellulaire sur de la glace pendant 45 minutes. Après 45 minutes sur la glace, grattez les cellules à l’aide de mini grattoirs à cellules.

Transférer doucement les macrophages détachés dans du PBS froid et du FBS à 5% dans un tube de 15 millilitres maintenu sur de la glace. Les macrophages dérivés de la méthode de polarisation montrent l’expression de CD14, ainsi que des marqueurs CD11b. Les marqueurs monocytaires et macrophages CD14 et CD11b ont été exprimés dans 70,9 % et 74,7 % des cellules, respectivement.

Les cellules ont montré de faibles niveaux de surface du marqueur de type M1 CD80 dans 0,2% des cellules, et des niveaux de surface élevés du marqueur de type M2 CD206 dans 62,6% des cellules. Comme les cellules THP-1 en milieu ont tendance à couler au fond d’un flacon et sont faciles à activer en raison de contraintes mécaniques, il est important de mélanger et de manipuler les cellules en douceur. Les macrophages de type M2 sont créés de manière reproductible et ont été caractérisés à l’aide de QR-TPCR, ELISA et de cytométrie en flux.

C’est la base pour étudier les mécanismes anti-inflammatoires dans le développement du cancer ou le remodelage des tissus.