Name: Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez la visualisation des volants membranaires par microscopie électronique à balayage chez les macrophages RAW 264.7. Cette méthode permet de quantifier la macropinocytose et d'identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire.

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Les auteurs remercient Libby Perry (Université Augusta) pour son aide dans la préparation de l’échantillon SEM. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) et K99HL146954 (B.S.)] et l’American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

REMARQUE: Ce qui suit est un protocole général utilisé pour quantifier la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 à l’aide de la microscopie SEM. Une optimisation peut être nécessaire pour différents types de cellules.
1. Lignée cellulaire et culture cellulaire
<ol><li>Cultiver des macrophages RAW 264,7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2. Remplacez les supports de croissance tous les deux jours.</li>
	<li>Lorsque les cellules deviennent confluentes à 80%, lavez la plaque deux fois à l’aide de PBS stérile.</li>
	<li>Détacher les cellules en ajoutant 1 000 μL de trypsine-EDTA à 0,5 % et incuber la plaque de culture cellulaire pendant 3 à 5 min dans un incubateur humidifié à 37 °C.</li>
	<li>Examinez la plaque au microscope optique pour confirmer la dissociation cellulaire. Ajouter 10 mL de milieux de croissance contenant 10 % de FBS pour inactiver la trypsine.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendez doucement les cellules dans le milieu de culture cellulaire complet et déterminez le nombre de cellules et la viabilité à l’aide de la coloration au bleu de trypan (0,4%). REMARQUE: La viabilité cellulaire minimale recommandée pour cette expérience est de >90%.</li>
	<li>Placez des couvercles de verre stériles dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces autoclavées. Ensemencez les cellules sur des couvercles à une densité de 1 x 106 cellules/mL et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Changer le milieu de chaque puits avec un milieu complet frais de 500 μL avant le traitement. Prétraiter les macrophages avec du véhicule (DMSO ou d’autres solvants utilisés pour dissoudre l’EIPA) ou l’inhibiteur de la macropinocytose 5-(N-éthyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA, 25 μM21) pendant 30 min.</li>
	<li>Traiter les cellules avec un véhicule et des stimulateurs de macropinocytose pour favoriser l’ébouriffement de la membrane: phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA, 1 μM, 30 min21) et facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, 100 ng / mL, 30 min3). REMARQUE: Des inhibiteurs alternatifs [par exemple, la latrunculine A (1 μM, 30 min) ou la cytochalasine D (1 μM, 30 min)] et des stimulateurs [par exemple, facteur de croissance épidermique (EGF, 100 ng / mL, 10 min) ou facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF, 100 ng / mL, 15 min)] de macropinocytose peuvent également être utilisés pour caractériser la macropinocytose chez les macrophages et d’autres types de cellules16,27, 28,29. Les cellules peuvent nécessiter une famine sérique pendant la nuit avant le traitement avec des stimulateurs physiologiques de la macropinocytose. Il est important de noter que les concentrations et les temps d’incubation les plus efficaces devront être déterminés pour stimuler la macropinocytose dans d’autres types de cellules.</li>
</ol>2. Fixation SEM
<ol><li>Après le traitement, aspirez les milieux des puits et lavez les couvercles avec du PBS glacé deux fois.</li>
	<li>Fixer les cellules (4 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde dans 0,1 M de cacodylate de sodium) pendant 30 min à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne dans le fixateur à 4 °C.</li>
	<li>Lavez et incubez délicatement les couvercles avec 500 μL de réactifs suivants sans perturber la monocouche cellulaire.<ol>
<li>Laver une fois dans 0,1 M de cacodylate de sodium et incuber pendant 15 min.</li>
		<li>Laver deux fois avec dH2O avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 25% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 50% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 75% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 80% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 95% avec 10 min d’incubation dans chaque lavage.</li>
		<li>Laver deux fois avec de l’éthanol à 100%. Effectuez 10 min d’incubation dans chaque lavage. REMARQUE: Le changement / remplacement des réactifs doit être effectué rapidement pour éviter le séchage à l’air des cellules. Les couvercles peuvent être laissés dans de l’éthanol à 100% pendant plusieurs jours à 4 °C. Pour un stockage à long terme, ajoutez de l’éthanol supplémentaire à 100 % et couvrez les puits avec un parafilm pour éviter le séchage à l’air de l’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Séchage des points critiques
<ol><li>Placez les couvercles dans un sécheur à points critiques et couvrez-les avec de l’éthanol à 100%. Appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de CO2 .</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Refroidir pendant environ 30 s jusqu’à ce que la température diminue à 0 °C. Appuyez sur le bouton Remplir jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol de l’échappement de purge disparaisse. Appuyez à nouveau sur le bouton Refroidir jusqu’à ce que la température diminue à 0 °C.</li>
	<li>Appuyez sur les boutons Fill et Purge pour les éteindre et fermer le réservoir de CO2 . Appuyez sur le bouton Cool pour l’éteindre et appuyez sur le bouton Heat .</li>
	<li>Réglez la température à 42 °C et la pression à 1 200 psi. Une fois la pression et la température stabilisées, appuyez sur le bouton Bleed pour permettre à la pression de diminuer lentement.</li>
	<li>Une fois que la pression de la chambre atteint 150 psi, appuyez sur le bouton Vent et attendez que la pression diminue à 0 psi. Éteignez le séchoir à points critiques et retirez les couvercles.</li>
	<li>Montez des couvercles sur des supports d’échantillons en aluminium SEM à l’aide de languettes d’adhésif carbone et soumis à un revêtement de pulvérisation à l’aide d’or / palladium dans un enduit de pulvérisation.</li>
	<li>Allumez le bouton d’alimentation et attendez que l’aspirateur atteigne 30 mTorr. Rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz Fine dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.</li>
	<li>Une fois que le vide augmente à 200 mTorr éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 mTorr. Répétez cette étape 3 fois.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Minuterie et ajustez le bouton Tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 mA. Retirez les couvercles enduits de la chambre. REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour effectuer le séchage aux points critiques et le revêtement par pulvérisation de l’échantillon.</li>
</ol>4. Imagerie et quantification
<ol><li>Insérez des couvercles d’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage. Fermez la porte et appuyez sur le bouton Evac .</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’opération SEM. Réglez la tension d’accélération sur 15 kv et la distance de travail sur 10 mm.</li>
	<li>Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous autour du contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation. Réglez le grossissement sur 3 500x et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo. REMARQUE: Utilisez un niveau de grossissement plus élevé (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails.</li>
	<li>Prenez des images d’au moins 10 endroits aléatoires sur les couvercles, en vous assurant que chaque champ microscopique contient plusieurs cellules. Enregistrez les images en tant que fichiers .tif.</li>
	<li>À partir des images, localisez les volants de membrane, définis comme des plis saillants en forme de couverture de la membrane plasmique, d’une taille supérieure à 500 nm (Figure 1). Comptez le nombre de volants par cellule. REMARQUE : Les volants en forme de C ont été identifiés comme des protubérances membranaires incurvées qui ne fusionnaient pas à leurs extrémités latérales [(Figure 1 (traitement M-CSF) et Figure 2B]. Des volants de membrane circulaire fusionnés, avant leur fermeture, ont été identifiés comme des ventouses macropinocytotiques (figure 2C).</li>
	<li>Normaliser le nombre de volants membranaires au nombre total de cellules dans le champ microscopique évalué. Répétez cette analyse pour les échantillons de chaque groupe.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. Bien que le protocole actuel se concentre sur les macrophages, des études ont montré que la formation de volants membranaires se produit également sur divers autres types de cellules, y compris les cellules dendritiques, les fibroblastes, les neurones et les cellules cancér...

La macropinocytose est un processus endocytaire responsable de l’internalisation d’une grande quantité de liquide extracellulaire et de son contenu via la formation de protubérances membranaires dynamiques et entraînées par l’actine appelées volants membranaires1. Beaucoup de ces volants membranaires forment des coupelles qui se ferment et fusionnent sur la cellule et se séparent de la membrane plasmique sous forme de gros endosomes intracellulaires hétérogènes également connus sous le nom de macropinosomes1. Bien que la macropinocytose soit induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et le facteur de croissance épidermique (EGF) dans un large éventail de types de cellules, un processus unique et dépendant du calcium connu sous le nom de macropinocytose constitutive a également été observé dans les cellules immunitaires innées 2,3,4,5,6,7,8.
Il a été démontré que la capacité des cellules à internaliser le matériel extracellulaire par macropinocytose joue un rôle important dans divers processus physiologiques allant de l’absorption des nutriments à la capture des agents pathogènes et à la présentation des antigènes 9,10,11. Cependant, parce que ce processus est non sélectif et inductible, il a également été impliqué dans un certain nombre de conditions pathologiques. En effet, des études antérieures ont suggéré que la macropinocytose joue un rôle important dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, le cancer, la néphrolithiase et l’athérosclérose 12,13,14,15,16. De plus, il a été démontré que certaines bactéries et certains virus utilisent la macropinocytose pour pénétrer dans les cellules hôtes et induire une infection17,18. Fait intéressant, la stimulation de la macropinocytose peut également être exploitée pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques dans diverses maladies19,20.
Des études antérieures ont exploré la macropinocytose en quantifiant les marqueurs de phase fluide intériorisés marqués par fluorescence en l’absence et en présence d’agents pharmacologiques qui inhibent la macropinocytose à l’aide de la cytométrie en flux et de l’imagerie confocale21,22. Les outils pharmacologiques actuellement disponibles qui inhibent la macropinocytose sont limités et comprennent 1) des inhibiteurs de polymérisation de l’actine (cytochalasine D et latrunculines), 2) des bloqueurs PI3K (LY-290042 et wortmannine) et 3) des inhibiteurs des échangeurs d’hydrogène sodique (NHE) (amiloride et EIPA)5,14,15,23,24,25 . Cependant, comme ces inhibiteurs ont des effets indépendants de l’endocytose, il est difficile de déterminer sélectivement la contribution de la macropinocytose à l’absorption du soluté et à la pathogenèse de la maladie, en particulier in vivo21.
La microscopie électronique à balayage (MEB) est un type de microscope électronique qui produit des images à ultra-haute résolution de cellules à l’aide d’un faisceau focalisé d’électrons26. Dans la recherche sur la macropinocytose, l’imagerie SEM est considérée comme la technique de référence pour visualiser les caractéristiques topographiques et morphologiques de la membrane plasmique, quantifier la formation de volants membranaires et étudier leur progression vers l’internalisation des macropinosomes. En outre, la microscopie électronique à balayage combinée à la quantification de l’absorption du soluté, en présence et en l’absence de bloqueurs de macropinocytose, fournit une stratégie fiable pour examiner l’internalisation du soluté macropinocytotique in vitro. Cet article fournit un protocole détaillé sur la façon de préparer les cellules pour le SEM, de visualiser la surface cellulaire, de quantifier la formation de volants et d’examiner leurs progrès vers la fermeture de la coupe et l’internalisation des macropinosomes.

<table><tbody><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>2 % Glutaraldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>281692</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-éthyl-N-isopropyl)-Amiloride</td><td>Sigma Life Science</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Cytomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>en fluxLanguettes adhésives en carbone</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>77825-09</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated TC-Plaque de culture cellulaire</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>FitC-dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i Incubateur CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Hummer Model 6.2 Sputter Coater</td><td>Anatech USA</td><td>58565</td><td></td></tr><tr><td>JSM-IT500HR microscope</td><td></td><td></td> <td>électronique à balayage</td></tr><tr><td>Couvercle de microscope Verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Stylo Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acétate</td><td>Millipore Sigma</td><td>524400</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 macrophage</td><td>ATCC ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Samdri-790 Sécheur à point critique</td><td>Tousimis Research Corporation</td><td>8778B</td><td></td></tr><tr><td>SEM Montures d’échantillon en aluminium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Texas red-dextra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr>Microscope <td></td><td></td><td></td><td>confocal Zeiss LSM 780</td></tr></tbody></table>

visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

L’ébouriffement membranaire est la formation de protubérances mobiles de membranes plasmiques contenant un maillage de filaments d’actine nouvellement polymérisés. Les volants membranaires peuvent se former spontanément ou en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires et des esters de phorbol. Certaines des protubérances membranaires peuvent se réorganiser en volants membranaires circulaires qui fusionnent à leurs marges distales et forment des coupelles qui se ferment et se séparent dans le cytoplasme sous forme de grandes vacuoles hétérogènes appelées macropinosomes. Au cours du processus, les volants piègent le liquide extracellulaire et les solutés qui s’internalisent dans les macropinosomes. La microscopie électronique à balayage (MEB) à haute résolution est une technique d’imagerie couramment utilisée pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupelles macropinocytaires fermées à la surface de la cellule. Le protocole suivant décrit les conditions de culture cellulaire, la stimulation de la formation de volants membranaires in vitro et la façon de fixer, de déshydrater et de préparer les cellules à l’imagerie à l’aide du MEB. La quantification des volants membranaires, la normalisation des données et les stimulateurs et inhibiteurs de la formation de volants membranaires sont également décrits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la macropinocytose dans les processus physiologiques et pathologiques, à étudier de nouvelles cibles qui régulent la formation des volants membranaires et à identifier des stimulateurs physiologiques encore non caractérisés ainsi que de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de la macropinocytose.

Ici, nous décrivons les résultats de la technique présentée. Les images SEM représentatives montrées à la figure 1 montrent la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 après un traitement par PMA et M-CSF. Les images ont d’abord été capturées à un grossissement de 3 500x à des fins de quantification, puis à des niveaux de grossissement plus élevés (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails. Le prétraitement des macrophages avec l’inhibi...

La macropinocytose est un processus endocytaire hautement conservé initié par la formation de projections membranaires en feuille riches en F-actine, également connues sous le nom de volants membranaires. L’augmentation du taux d’internalisation du soluté macropinocytotique a été impliquée dans diverses conditions pathologiques. Ce protocole présente une méthode pour quantifier la formation de volants membranaires in vitro à l’aide de la microscopie électronique à balayage.

Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. SEM fournit des images haute résolution de la surface cellulaire qui peuvent être utilisées pour visualiser les activités de la membrane macropinocytaire. Cette technique peut être utilisée pour découvrir de nouvelles voies de signalisation régulant la macropinocytose et identifier de nouveaux stimulateurs et inhibiteurs de la micropinocytose.Commencez par placer des glissières de couverture en verre stérile dans les puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces autoclavées. Ensuite, ensemencez 264,7 macrophages bruts sur la couverture glisse à une densité de 10 à la sixième cellule par millilitre et incubez la plaque pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez les milieux dans chaque puits par 500 microlitres de milieux complets frais, puis prétraitez les macrophages pendant 30 minutes avec un contrôle de véhicule tel que le DMSO ou un inhibiteur de macropinocytose tel que l’EIPA.Ensuite, pour favoriser l’ébouriffement de la membrane, traitez les cellules pendant 30 minutes avec des stimulateurs de macropinocytose, tels qu’une solution de PMA à un micromolaire ou 100 nanogrammes par millilitre de facteur stimulant les colonies de macrophages. Pour fixer les cellules pour la microscopie électronique à balayage, aspirez le milieu des puits et lavez les feuillets de couverture deux fois avec du PBS glacé, puis incubez les glissements de couverture dans un fixateur pendant 30 minutes à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain, sans déranger la monocouche cellulaire, lavez doucement puis incubez les feuillets de couverture dans 500 microlitres de cacodylate de sodium à 0,1 moteur pendant 15 minutes.Après deux lavages avec 500 microlitres d’eau distillée, lavez les couvercles deux fois dans 500 microlitres d’une série d’éthanol gradué avec une incubation de 10 minutes à chaque lavage. Pour effectuer un séchage aux points critiques, placez les glissières de couverture dans un séchoir à points critiques et recouvrez-les d’éthanol à 100%. Ensuite, appuyez sur le bouton d’alimentation et ouvrez le réservoir de dioxyde de carbone.Appuyez sur le bouton de refroidissement pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Ensuite, appuyez sur le bouton de remplissage jusqu’à ce qu’une bulle apparaisse dans la fenêtre de la chambre. Ensuite, appuyez sur le bouton de purge jusqu’à ce que l’odeur d’éthanol de l’échappement de purge disparaisse.Ensuite, appuyez à nouveau sur le bouton de refroidissement jusqu’à ce que la température diminue à zéro degré Celsius. Appuyez à nouveau sur les boutons plein et purge pour les éteindre. Ensuite, fermez le réservoir de dioxyde de carbone.Appuyez à nouveau sur le fond froid pour l’éteindre, puis appuyez sur le bouton de chauffage. Réglez la température à 42 degrés Celsius et la pression à 1 200 livres par pouce carré. Une fois la pression et la température stabilisées, appuyez sur le bouton de purge pour permettre à la pression de diminuer lentement.Une fois que la pression de la chambre atteint 150 livres par pouce carré, appuyez sur le fond de l’évent et attendez que la pression diminue à zéro livre par pouce carré. Éteignez le séchoir à points critiques et retirez les glissières de couverture. Ensuite, à l’aide de robinets adhésifs au carbone, montez les glissières de couverture sur les supports d’échantillon en aluminium pour la microscopie électronique à balayage, puis procédez au revêtement de pulvérisation à l’aide d’or ou de palladium dans un enduit de pulvérisation.Allumez le bouton d’alimentation de l’enduit de pulvérisation. Une fois que le vide atteint 30 millitorrs, rincez la chambre pour éliminer l’humidité et l’air en éteignant l’interrupteur à gaz et en tournant la vanne de gaz fin dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Une fois que le vide augmente à 200 millitorrs, éteignez l’interrupteur à gaz et attendez que le vide atteigne 30 millitorrs.Ensuite, rincez à nouveau la chambre pour éliminer l’humidité et l’air comme démontré. Après avoir rincé la chambre trois fois, appuyez sur le fond de la minuterie et ajustez le bouton de tension jusqu’à ce que la jauge indique 10 milliampères. Ensuite, retirez les glissements de couverture enduits de la chambre.Pour visualiser et quantifier les volants de la membrane, insérez les glissements du couvercle de l’échantillon dans la chambre d’un microscope électronique à balayage, fermez la porte et appuyez sur le bouton d’évacuation. Ouvrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la tension d’accélération à 15 kilovolts et la distance de travail à 10 millimètres. Appuyez sur le bouton Coordonnées et déplacez-vous autour du contrôleur jusqu’à ce que les cellules apparaissent au centre de l’écran d’observation.Réglez le grossissement sur 3 500 X et imagez l’échantillon en cliquant sur le bouton Photo. Voici des images représentatives de microscopie électronique à balayage, démontrant la formation de volants membranaires dans 264,7 macrophages bruts après traitement par PMA et facteur de stimulation des colonies de macrophages. Le prétraitement des macrophages avec l’inhibiteur de macropinocytose EIPA atténue la formation de volants membranaires.Au cours de la formation des volants, la membrane plasmique subit des étapes morphologiques distinctes, notamment une saillie membranaire en forme de feuille, un volant membranaire en forme de C et une coupe macropinocytaire. La formation de volants membranaires après des traitements de facteur de stimulation des colonies de PMA et de macrophages peut être quantifiée à l’aide de la microscopie électronique à balayage, tandis que la formation de macropinosomes peut être confirmée par d’autres techniques d’imagerie, telles que la microscopie confocale utilisant le dextran rouge du Texas et FM4-64. Les flèches bleues indiquent des volants de membrane, tandis que les flèches jaunes et vertes pointent vers les micropoinosomes.Enfin, la macropinocytose peut être confirmée et quantifiée par cytométrie en flux à l’aide d’un marqueur de phase fluide fluorescent tel que le FITC ou le dextran rouge du Texas. En plus de la MEB, l’imagerie des cellules vivantes et l’analyse par cytométrie en flux de l’internalisation de la dextran marquée par fluorescence peuvent également être effectuées pour étudier et quantifier la macropinocytose.

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JoVE Journal

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Médecine

Cette vidéo montre la préparation d’échantillons, la fixation et l’imagerie d’une cellule de macrophage qui présente des volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage, MEB. Des informations détaillées sur la morphologie et l’organisation des membranes sont cruciales pour comprendre l’état physiologique des cellules.

Quantification de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

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Visualisation de réticulum endoplasmique sous-domaines dans les cellules cultivées

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Techniques et d'améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanotechnologie.

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Ici, nous présentons un protocole pour détecter un seul, les événements de fusion SNARE médiation entre liposomes et bicouches pris en charge dans des canaux microfluidiques utilisant TIRFM polarisée, avec une sensibilité et une seule molécule ~ 15 résolution temporelle msec. Lipid et la libération de la cargaison soluble peuvent être détectés simultanément. la taille des liposomes, des lipides diffusivité et la fusion des pores propriétés sont mesurées.

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Solide-soutenus, sans protéines, double membranes bicouches phospholipidiques (DALG) peuvent être transformés en réseaux de nanotube de lipides complexes et dynamiques et peuvent servir de modèles 2D de bas en haut du réticulum endoplasmique.

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Nous décrivons la préparation de rubans de sections série et leur collecte sur un grand support de transfert pour une utilisation en tant qu’échantillons de tomographie en réseau, ainsi que des procédures d’imagerie automatisées dans un microscope électronique à balayage. Le protocole permet le dépistage, la récupération et l’imagerie ciblée d’événements locaux rares, ainsi que l’acquisition de grands volumes de données.

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Les septines sont des protéines cytosquelettiques. Ils interagissent avec les membranes lipidiques et peuvent détecter mais aussi générer une courbure de membrane à l’échelle du micron. Nous décrivons dans ce protocole des méthodologies in vitro ascendantes pour l’analyse des déformations membranaires, la liaison de la septine sensible à la courbure et l’ultrastructure du filament de septine.

Méthodes in vitro ascendantes pour tester l’organisation ultrastructurale, le remodelage de la membrane et le comportement de sensibilité à la courbure des septines

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

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Ce protocole vidéo illustre comment effectuer une tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage d’échantillons virologiques. Pour des résultats optimaux, les échantillons sont préparés par congélation à haute pression et substitution ultérieure de la congélation.

Tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage en virologie : imagerie 3D d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation

Découvrez la visualisation des volants membranaires par microscopie électronique à balayage chez les macrophages RAW 264.7. Cette méthode permet de quantifier la macropinocytose et d'identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire.

Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

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