Analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques dans les cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D

La cytométrie de flux est une technique puissante qui permet l’analyse multiparamétrique de cellules individuelles. Il peut identifier les biomarqueurs de l’apoptose précoce et tardive avec précision et rapidité en analysant des millions de cellules. Plusieurs molécules cellulaires sont colorées et détectées simultanément.

En particulier, la cytométrie de flux de paillasse permet l’analyse et l’interprétation par des cytométristes de flux non experts. Esther Zhou, une étudiante de troisième cycle du groupe du cancer de la vitamine D, fera la démonstration de la procédure. Commencez par cultiver les cultures cellulaires dans un environnement de CO2 humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.

S’assurer que la culture cellulaire est confluente à environ 70 % dans le ballon parent avant de faire passer les cellules pour les expériences. Retirer le milieu de la fiole et laver les cellules avec 1X PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine pour détacher les cellules.

Une fois que les cellules commencent à se détacher, neutralisez la trypsine en ajoutant environ cinq millilitres de milieu de culture frais complété par 10% de sérum de veau fœtal avant de compter les cellules. Cellules de semence à 15 000 cellules par millilitre dans trois millilitres de milieu de culture cellulaire dans une plaque de culture cellulaire à six puits. Incuber les plaques de culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pour permettre la fixation des cellules au fond du puits.

Le lendemain, traiter les cultures expérimentales avec 100 nanogrammes par millilitre d’actinomycine D et les témoins de milieu et de solvant avec un milieu de culture frais et du DMSO, respectivement, pendant 24 heures. Retirez le milieu des puits et recueillez le milieu usé dans un tube de 15 millilitres. Lavez les cellules avec 1X PBS.

Ajouter 500 microlitres de trypsine pour détacher les cellules. Rétroverser doucement un millilitre de milieu deux à trois fois pour déloger mécaniquement les cellules restantes encore attachées au fond du puits. Ajouter la solution des puits dans un tube de 15 millilitres, puis ajouter cinq millilitres de milieu de culture frais pour neutraliser la trypsine.

Pipette 450 microlitres de réactif contenant des colorants de liaison à l’ADN dans un tube microcentrifugé. Ajouter 50 microlitres de la suspension cellulaire dans le tube de microcentrifugeuse. Incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes.

Dénombrer les cellules par cytométrie de flux. Diluer tous les échantillons à une concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre avec un milieu de culture cellulaire avant de procéder aux tests d’apoptose. Pour détecter l’extériorisation de la phosphatidylsérine à l’aide d’une annexine V, ajouter 100 microlitres de suspension cellulaire dans un tube microcentrifugeur.

À cela, ajoutez 100 microlitres d’un mélange 1: 1 d’annexine V conjuguée fluorescente et de réactif 7-AAD. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes, à l’abri de la lumière. Pour l’analyse de la dépolarisation de la membrane mitochondriale, commencez par centrifuger 100 microlitres de la suspension cellulaire à 300 fois G pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de 1X PBS. Ajouter 100 microlitres de solution de coloration TMRE à chaque échantillon et mélanger la suspension par rétropipetage doux. Enveloppez les échantillons dans du papier d’aluminium propre pour les protéger de la lumière et incuber les cellules pendant 20 minutes dans un environnement de CO2 humidifié à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, ajoutez la solution de travail 7-AAD à l’échantillon et mélangez-le. Pour détecter les caspases terminales activées 3 et 7, commencez par diluer le peptide de liaison à l’ADN lié à DEVE dans le DMSO dans un rapport de 1:8 avec du PBS 1X stérile pour que la solution de détection des caspases fonctionne. Conservez la solution sur de la glace ou ajoutez-la de deux à huit degrés Celsius, à l’abri de la lumière.

Ajoutez deux microlitres d’une solution mère 7-AAD à 148 microlitres de PBS 1X pour obtenir la solution de travail 7-AAD. Conservez la solution sur de la glace ou à une température de deux à huit degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Centrifuger 50 microlitres de la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 300 fois G et jeter le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de 1X PBS, suivis de cinq microlitres de la solution de travail de détection de caspases et mélangez bien. Desserrez le bouchon des tubes et incuber pendant 30 minutes dans un environnement de CO2 humidifié à 37 degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Ajouter 150 microlitres de la solution de travail 7-AAD à chaque échantillon et mélanger.

Incuber pendant cinq minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour la détection des cassures de l’ADN double brin et des dommages totaux à l’ADN, centrifugez d’abord 50 microlitres de la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 300 fois G et jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de 1X PBS et ajoutez 500 microlitres d’un tampon de fixation à base de formaldéhyde et mélangez.

Incuber les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois G et jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 90 microlitres de 1X PBS dans un tube microcentrifugeux.

Ajouter 10 microlitres de la solution d’anticorps dans le tube microcentrifugé. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité. Ajouter 100 microlitres de 1X PBS et centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois G.Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 200 microlitres de 1X PBS.

Mélanger l’échantillon en l’arrosant doucement avant de charger l’échantillon sur le cytomètre en flux. Vérifier la performance analytique du cytomètre en flux en exécutant la trousse de vérification du système de l’instrument et ne pas procéder à l’exécution des échantillons tant que toutes les vérifications ne sont pas terminées et réussies. Tout d’abord, chargez un échantillon témoin négatif sur le cytomètre en flux et sélectionnez Exécuter, Ajuster les paramètres, afin que l’instrument commence à aspirer l’échantillon et fournisse un aperçu en temps réel des événements détectés.

À l’aide de l’aperçu en direct, ajustez les seuils de fluorescence et de taille des cellules. Dessinez une porte rectangulaire autour de la population cellulaire, faites glisser le marqueur de seuil pour exclure les débris cellulaires, puis sélectionnez Suivant, Définir le profil d’apoptose pour continuer. Appuyez et faites glisser les marqueurs de quadrant pour séparer les populations cellulaires et tracer les événements détectés en temps réel.

Utilisez ces diagrammes pour guider l’utilisateur final sur l’emplacement approprié des marqueurs du quadrant. Sélectionnez Suivant, Vérifier les paramètres pour continuer afin que l’instrument affiche un résumé des paramètres. Après avoir examiné les paramètres, sélectionnez Suivant, Paramètres de fin pour appliquer ces paramètres à tous les exemples de l’expérience.

Mélanger le premier échantillon en l’arrosant doucement et charger le premier échantillon sur le cytomètre en flux. Sélectionnez Suivant, puis nommez l’exemple et sélectionnez Exécuter pour que le système commence à exécuter l’exemple. Si nécessaire, effectuer un réglage fin des barrières ou des marqueurs de quadrant après l’acquisition.

Localisez l’expérience qui nécessite un ajustement en naviguant dans le navigateur de fichiers du système et ouvrez l’expérience. Appuyez sur l’aperçu miniature de l’intrigue pour l’agrandir. Pour ajuster les marqueurs de quadrant, cliquez sur l’intersection des lignes verticales et horizontales pour déplacer les marqueurs tels quels, puis ajustez l’angle de l’une ou l’autre ligne en cliquant sur la ligne et faites glisser la poignée.

Pour affiner le point de contrôle de la cellule, cliquez sur l’onglet Porte et ajustez les dimensions de la porte. Ajustez les marqueurs comme vous le souhaitez et appliquez ces paramètres à tous les échantillons de l’expérience en sélectionnant l’icône de coche, en marquant tous les échantillons et en sélectionnant Accepter. Effectuer des tests en triple exemplaire et effectuer une analyse de variance avec un test de Bonferroni post hoc pour évaluer les différences significatives entre les échantillons et les témoins.

Les résultats du nombre de cellules et de la viabilité ont montré que 95,2% des cellules de l’échantillon étaient vivantes et 4,8% étaient mortes. La concentration cellulaire s’est avérée être 5,90 fois 105 cellules par millilitre. Le test d’annexine V et de mort cellulaire a montré une augmentation significative des cellules apoptotiques dans les cellules SiHa traitées avec 100 nanogrammes par millilitre d’actinomycine D, par rapport aux témoins.

Le test de potentiel transmembranaire électrochimique mitochondrial a démontré une diminution significative des profils de santé cellulaire entre l’actinomycine-D, le contrôle du milieu et le contrôle du solvant, ce qui suggère que 100 nanogrammes par millilitre d’actinomycine D induisaient une dépolarisation mitochondriale dans les cellules SiHa. Les essais de caspases-3 et 7 ont démontré une activation significative des caspases terminales dans les cellules SiHa traitées avec 100 nanogrammes par millilitre d’actinomycine D, par rapport aux témoins. L’actinomycine D a induit de manière significative des marqueurs de dommages à l’ADN, ATM et H2A.

X dans les cellules SiHa, ce qui suggère une augmentation significative des dommages à l’ADN. Pour améliorer la précision, assurez-vous de récolter la population cellulaire totale. Respectez également les concentrations cellulaires et les temps de coloration recommandés par le fabricant.

La protection des échantillons colorés de la lumière évite le photoblanchiment ou les fluorophores. L’analyse biochimique de l’apoptose par cytométrie en flux doit être soutenue par microscopie. Cela permettra d’identifier les caractéristiques morphologiques de l’apoptose classique.

Les caractéristiques comprennent la condensation nucléaire, le mélange de la membrane cellulaire, les corps apoptotiques et la caryorrhexis.