Name: Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Apprenez la culture, la purification et le titrage du virus oncolytique de l'herpès simplex pour la recherche préclinique en immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode simple produit des stocks viraux de haute qualité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recherche dans le laboratoire Saha a été financée en partie par des fonds du DOD (W81XWH-20-1-0702) et de la Fondation Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin et Melissa R.M. Humphrey ont été partiellement soutenus par les NIH (R01 CA160762).

1) Croissance de l’oHSV
NOTA : Assurer l’approbation du comité de biosécurité de l’établissement avant de travailler avec le VSSO. Cette étude a été menée dans le cadre du Protocole N° 18007 approuvé par le CIB. Maintenir les précautions BSL2 : blanchir toutes les pipettes, pointes, tubes et autres matières qui entrent en contact avec le virus. Vaporisez les gants avec 70% d’alcool isopropylique avant que les mains ne quittent la hotte de culture cellulaire BSL2. Lavez-vous toujours soigneusement les mains à l’eau savonneuse après avoir travaillé avec un virus.
<ol><li>Le jour -1, ensemencer des cellules Vero à faible passage dans des fioles de20 T-150 cm 2 à une densité de 7-8 × 106 cellules/fiole en milieu cellulaire vero régulier. REMARQUE : Le milieu vero est préparé en complétant le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (IFCS).</li>
	<li>Le jour 0 (les cellules sont confluentes à 80-90%), ajouter l’inoculum oHSV sur les cellules Vero.<ol>
<li>Préparation du virus inoculum<ol>
<li>Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 (MOI peut varier de 0,01 à 0,1 selon la capacité de réplication du virus) pour l’amplification du virus. Utilisez la formule (1) pour calculer la quantité de virus (mL) pour 20 fioles. Quantité de virus (mL) pour 20 fioles = quantité de virus nécessaire (pfu)/titre du stock de virus (pfu/mL)(1)</li>
			<li>Utiliser la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à haute teneur en glucose, complétée par un IFCS à 1 % pour préparer l’inoculum du virus (7 mL par fiole T-150 cm2, c.-à-d. environ 140 mL pour 20 fioles). Ajouter la quantité requise d’oHSV à 140 mL de solution de DPBS à haute teneur en glucose/1% d’IFCS, vortex pendant 1 min, et garder le mélange prêt pour l’ajout aux cellules Vero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laver les fioles T-150 cm2x avec du DPBS à haute teneur en glucose complété par un IFCS à 1% (10 mL/lavage). Aspirer le DPBS/IFCS à 1 % et ajouter 7 mL de fiole d’inoculum du virus/T-150 cm2.</li>
		<li>Balancer doucement les fioles pendant 5 min à l’aide d’une bascule à ballon pour une bonne répartition de l’inoculum sur la monocouche Vero, puis incuber les fioles à 37 °C pendant 1,5 à 2 h. Assurez-vous que l’étagère de l’incubateur est de niveau.</li>
		<li>Retirer l’inoculum et ajouter le DMEM complété par 1 % d’IFCS (25 mL/fiole). Incuber les fioles pendant 2-4 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vérifiez quotidiennement les fioles pour 90-100% CPE (voir figure 2).</li>
	<li>Récoltez les cellules vero infectées par le vhso.<ol>
<li>Recueillir le surnageant de culture (~20 mL) de chaque fiole (laisser ~5 mL dans chaque fiole) dans des tubes à centrifuger coniques ou un contenant de support de 50 mL.</li>
		<li>Utilisez un grattoir à cellules pour gratter doucement les cellules du fond des flacons. REMARQUE: Les cellules doivent rapidement se détacher des flacons.</li>
		<li>Ajouter ~15 mL du surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) à chaque fiole (ce qui porte le volume d’environ 20 mL dans chaque fiole, soit 400 mL pour 20 fioles) et laver délicatement le fond des fioles à quelques reprises à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL. Remarque : Ne pas pipet vigoureusement. Visez à garder toutes les cellules intactes.</li>
		<li>Recueillir les cellules (+ milieu) dans des tubes à centrifuger coniques de 50 mL sur de la glace (utiliser 8 tubes pour contenir 400 mL de cellules récoltées dans 20 flacons).</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 1,25 mL (50 %) de tampon antivirus (VB) et 1,25 mL (50 %) de surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) dans chaque tube de centrifugation et re-suspendre soigneusement chaque pastille. Transférer les cellules remises en suspension de huit tubes à centrifuger de 50 mL vers un tube de centrifugation conique de 50 mL. Remarque : Reportez-vous à la préparation de la solution VB dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution VB à l’aide d’un filtre de stérilisation de milieu. Utiliser 0,5 mL de VB + 0,5 mL de surnageant par fiole T-150 cm2 pour la re-suspension, c’est-à-dire pour 20 fioles (20 mL), utiliser 10 mL de VB et 10 mL de surnageant de culture.</li>
		<li>Congeler les cellules re-suspendues à l’aide de glace carbonique/éthanol à 100 % et les conserver à -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) Purification de l’oHSV
<ol><li>Gel instantané (dans la glace carbonique et 100% éthanol)/dégel (dans un bain d’eau chaude à 37 °C) les cellules suivies d’une sonication au bain-marie pendant 1 min pendant un total de 3 cycles pour assurer une lyse appropriée des cellules pour libérer le virus dans le surnageant. REMARQUE: Effectuez une sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz et 120 V. Si un sonicateur accordable n’est pas disponible, utilisez un sonicateur de bain d’eau à ultrasons. Prenez une aliquote de 50 μL pour le titrage à la section 3, ce qui aidera à déterminer laquelle des étapes suivantes est responsable de la perte potentielle du virus pendant la procédure de purification.</li>
	<li>Traiter le lysat cellulaire avec de la benzonase nucléase (175 unités/mL) + 2 mMMgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), du vortex et incuber pendant 30 min à 37 °C. Placez le tube sur de la glace et effectuez les étapes suivantes à 4 °C.</li>
	<li>Pelleter les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse.<ol>
<li>Faire tourner le lysat cellulaire à 300 g pendant 10 min.</li>
		<li>Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé-1 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).</li>
		<li>Faire tourner à nouveau le surnageant (obtenu à l’étape 2.3.2) à 500 g pendant 10 min.</li>
		<li>Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé 2 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).</li>
		<li>Mélanger le granulé-1 en suspension (à partir de 2.3.2) et le granulé-2 (à partir du point 2.3.4) dans un nouveau tube à centrifuger de 1,7 mL, un vortex/sonique (bain d’eau) 2x, et tourner à 400 g pendant 10 min. Prélever le surnageant et le combiner avec le surnageant obtenu à l’étape 2.3.4 ; voir figure 1). REMARQUE: Effectuez la sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz, 120 V pour empêcher l’agrégation virale avant la procédure de filtration à l’étape 2.4. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant combiné pour le titrage à la section 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrer le surnageant combiné (~21 mL, c.-à-d. 20 mL de 1.4.6, 0,5 mL de 2.3.2 et 0,5 mL de 2.3.4) en utilisant la méthode de filtration en 3 étapes suivante.<ol>
<li>Prélever 21 mL du surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL (5-7 mL à chaque fois pour faciliter le passage à travers le filtre) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile de 5 μm de difluorure de polyvinylidène (PVDF) placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 1).<ol>
<li>Ajouter 1 mL de VB à un tube de centrifugeuse conique de 50 mL vidé au point 2.4.1 (pour recueillir la quantité infime restante de surnageant viré), vortex, et passer à travers le même filtre PVDF de 5 μm placé sur le TUBE 1 (portant le total à 22 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prélever 22 mL du filtrat du TUBE 1 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile à ester de cellulose mixte (ECM) de 0,8 μm placé sur un nouveau tube à centrifugeuse conique de 50 mL (étiqueté tube 2).<ol>
<li>Ajouter 1 mL de VB au TUBE 1 vidé à l’étape 2.4.2, vortex, et le faire passer à travers le même filtre MCE de 0,8 μm placé sur le TUBE 2 (portant le total à 23 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prélever 23 mL de filtrat du TUBE 2 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 μm placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 3).<ol>
<li>Ajouter 1 mL de VB au TUBE 2 vidé à l’étape 2.4.3, vortex, et le faire passer à travers le même filtre PVDF de 0,45 μm placé sur le TUBE 3 (portant le total à 24 mL de filtrat). NOTA : Prendre une partie aliquote de 50 μL du filtrat pour le titrage à la section 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugation à grande vitesse utilisant la méthode du gradient de saccharose REMARQUE: Un rotor F13-14x50cy à angle fixe a été utilisé dans ce protocole. Le rotor et la centrifugeuse doivent être à 4 °C avant de procéder aux étapes suivantes.<ol>
<li>Ajouter 10 mL d’une solution de saccharose à 25 % glacée et filtrée stérile (préparée en dissolvant 25 g de poudre de saccharose dans 100 mL de la solution saline équilibrée de Hank) dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 mL.</li>
		<li>Ajouter lentement (3 mL/min) 24 mL du filtrat du virus (obtenu à l’étape 2.4.3.1) au-dessus de la couche de saccharose. Prenez soin de maintenir des couches séparées du filtrat de virus et de la solution de saccharose. REMARQUE: Jusqu’à 30 mL de la couche virale peuvent être ajoutés sur 10 mL de la solution de saccharose.</li>
		<li>Centrifuger le tube pendant 90 min à 22 620 g à 4 °C.</li>
		<li>Retirer le surnageant et la couche de saccharose du tube de centrifugation conique de 50 mL. REMARQUE: Le culot de virus doit être blanchâtre. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant et une aliquote de 50 μL de la couche de saccharose pour le titrage à la section 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Re-suspendre le culot dans une solution de glycérol/PBS à 10 %.<ol>
<li>Ajouter 1 mL de glycérol stérile à 10 % (dilué dans du PBS) au tube de centrifugation conique de 50 mL pour couvrir la pastille. NOTA : La quantité du mélange en suspension peut varier (par exemple 0,8 à 1,2 mL) en fonction de la taille de la pastille. Un volume plus petit donnerait une concentration plus élevée de virus.</li>
		<li>Placer le tube de centrifugation conique de 50 mL sur de la glace pendant 2-4 h. Pendant cette période, soniquez/vortex la pastille toutes les 15 minutes pendant 30 s pour aider à déloger/re-suspendre la pastille.</li>
		<li>Recueillir la pastille en suspension (1 mL de glycérol à 10% / PBS + la taille de la pastille amènera le volume total à ~ 1,3 mL) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL. [Facultatif : Ajouter un autre 0,3 mL de glycérol/PBS à 10 % au même tube de centrifugation conique de 50 mL pour recueillir la quantité de trace restante de la pastille, pipet de haut en bas, et combiner avec la pastille re-suspendue à l’étape 2.6.3 pour porter le volume total à ~1,6 mL.]<ol>
<li>Si la suspension à l’étape 2.6.3 est trouble ou trouble (due à des débris cellulaires), centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL et passer à l’étape 2.6.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendre une aliquote de 50 μL pour le titrage du vHS OHS à la section 3. Aliquote le reste de la solution (250 μL/aliquote) dans des tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis (bien scellés pour le stockage à long terme), congélation instantanée et conservation à -80 °C jusqu’à l’utilisation (prête pour des études expérimentales une fois le titre de l’oHSV déterminé). NOTA : Toutes les matières qui entrent en contact avec le virus doivent être blanchies ou traitées par rayonnement ultraviolet avant d’être retirées de la hotte ou éliminées.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Titrage du vHS OHSV et dosage de la plaque
<ol><li>Semences 1,7-1,8 x 105 cellules vero/puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits en milieu cellulaire vero (DMEM avec 10% IFCS; voir étape 1.1). REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont réparties de manière homogène dans tout le puits; ne faites pas tourbillonner la plaque, ce qui peut provoquer une accumulation de cellules au milieu des puits. Pour éviter de tourbillonner, basculez lentement la plaque à la main verticalement, puis horizontalement, puis placez doucement la plaque dans l’incubateur.</li>
	<li>Le lendemain (quand les cellules atteignent 70-80% confluence), aspirez le milieu de culture, et ajoutez 1 mL/puits de PBS de haut-glucose complété avec 1% IFCS. Laisser la plaque dans la hotte de culture cellulaire jusqu’à ce que l’étape 3.3 soit terminée.</li>
	<li>Diluer le virus en série dans des tubes de polypropylène de 5 mL à l’aide de PBS/IFCS à 1 %(figure 3). NOTA : Utiliser la partie aliquote de 50 μL recueillie à l’étape 2.6.4 pour la dilution en série. Dans le1er tube (dilution 10-3), ajouter 2 μL du virus en 1998 μL de PBS/1 % IFCS, vortex. Dans le 2ième tube (dilution 10-5), prendre 10 μL du 1er tube dans 990 μL de PBS/1% IFCS, vortex. Dans le3ème tube (dilution 10-6), prendre 100 μL du 2ème tube dans 900 μL de PBS/1% IFCS, vortex; poursuivre cette dilution sérielle 10 fois jusqu’à une dilution de 10à 9. Voir les détails dans Figure 3.</li>
	<li>Aspirer pbs/1% IFCS, et ajouter 0,7 mL/puits du virus dilué en série (à partir de10-5 à 10-9) aux cellules vero. REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sécher.</li>
	<li>Balancer doucement la plaque sur une bascule pendant 5 min à température ambiante (pour assurer une distribution homogène de l’inoculum du virus).</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 1,5 h à 37 °C. REMARQUE: Pendant cette période d’incubation, préparer une dilution de 1:1000 de l’immunoglobuline humaine G (IgG) dans le DMEM complété par un IFCS à 1%. Pour une plaque de 6 puits, préparer 12,5 mL de sorte que 2 mL/puits puissent être utilisés à l’étape 3.7. Ajuster la dilution pour tenir compte des variations de lot dans les IgG humaines.</li>
	<li>Retirer l’inoculum du virus des puits et ajouter 2 mL/puits d’IgG humaine à 0,1 % (pour neutraliser l’oHSV dans le milieu de culture et prévenir la formation de plaques secondaires) dans du DMEM complété par 1 % d’IFCS. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3-4 jours. REMARQUE: Les plaques claires se forment généralement en 3 jours.</li>
	<li>Plaques de fixation et de coloration<ol>
<li>Retirez le surnageant et fixez les cellules dans du méthanol pur (1 mL/puits) pendant 5 min. Retirez le méthanol et laissez les plaques sécher à l’air.</li>
		<li>Diluer la tache de Giemsa (1:5) avec de l’eau désionisée et ajouter 1 mL de la tache de Giemsa diluée par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10-15 min.</li>
		<li>Enlevez la tache, rincez à l’eau du robinet et laissez les plaques sécher à l’air.</li>
		<li>Comptez les plaques à l’aide d’un microscope à dissection.</li>
		<li>Facultatif pour les vHS o avec expression lacZ :<ol>
<li>Retirez le surnageant et fixez les cellules avec du glutaraldéhyde à 0,2% froid / 2% de paraformaldéhyde pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.</li>
			<li>Retirez la solution fixatrice et lavez les cellules 3x avec du PBS.</li>
			<li>Ajouter une solution X-gal aux cellules (1 mL/puits) et incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h. REMARQUE: La tache X-gal doit être préparée fraîchement le jour de la coloration; le stockage à long terme peut entraîner une décoloration de la couleur. Voir la préparation de la solution X-gal dans le tableau 1.</li>
			<li>Retirez la tache X-gal et lavez la plaque avec de l’eau du robinet pendant 1 min.</li>
			<li>Contre-coloration avec solution rouge neutre (1 mL/puits) pendant 2 min à température ambiante. NOTA: Voir préparation de la solution rouge neutre dans le tableau 1.</li>
			<li>Laver l’assiette avec de l’eau du robinet pendant 1 min; laisser sécher les plaques à l’air.</li>
			<li>Comptez les plaques bleues à l’aide d’un microscope à dissection (Figure 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Calculer le titre à l’aide de la formule (2) Titre en pfu/mL (unités formant plaque) = Nombre de plaques/0,7 mL facteur de dilution × (2) REMARQUE: Par exemple, si 25 plaques sont trouvées dans le puits de dilution10 -9, le titre est de 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Il s’agit du titre final oHSV des aliquotes préparées à l’étape 2.6.4.</li>
</ol>

<ol><li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses%3A+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li>
<li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+herpes+viruses+as+oncolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).</li>
<li>Nguyen, H. -M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virotherapy%22%5BJournal%5D)">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li>
<li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside%3A+an+overview+of+current+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514(2020).</li>
<li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy%3A+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).</li>
<li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400(2020).</li>
<li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+growth%2C+preparation%2C+and+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407(2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li>
<li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li>
<li>Herpes simplex virus: methods and protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).</li>
<li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+trial+to+prepared+%CE%B31+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Review+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li>
<li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-Flop+HSV-BAC%3A+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40(2006).</li>
<li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li>
<li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).</li>
<li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li>
<li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li>
<li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li>
<li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224(2013).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel%2C+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).</li>
<li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li>
<li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).</li>
</ol>

SDR est co-inventeur de brevets relatifs aux virus oncolytiques de l’herpès simplex, détenus et gérés par l’Université de Georgetown et le Massachusetts General Hospital, qui ont reçu des redevances d’Amgen et d’ActiVec Inc. et fait partie du conseil consultatif scientifique de EG 427. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero20. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en suspension dans VB /...

Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)1 tout en induisant une immunité antitumorale2. Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé3. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.
Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV9,10,11,12, 13carles cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interférondéfectueuse 14. D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souventmg2+,1-2 mMMgCl2 est utilisé dans ce protocole15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa17 ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)18.

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td></td> en polypropylène <td>Sigma</td> CLS3620 <td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352097</td> 5 mL Tubes à centrifuger en polypropylène Falcon 352063 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nucléase</td><td>Sigma</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Racleur</td> cellulaire <td>Fisher Scientific</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium</td><td>modifié Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Tamponné Saline</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>à haute teneur en glucose Dulbecco' s Saline</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobuline humaine</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de stérilisation, 250 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de stérilisation des supports, 500 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>Solution rouge neutre</td><td>Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher scientific</td><td>&nbsp ; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>Culbuteur à plaques</td><td>Fisher</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>Ferricyanure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,45 PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 5 & micro ; m PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150 flacon de culture</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à ultrasons</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.

Un bref aperçu de l’ensemble du protocole est représenté à la figure 1,qui représente les étapes critiques impliquées dans la croissance, la purification et le titrage de l’oHSV. Les CPE dans les cellules Vero peuvent être détectées dès 4 h après l’infection par le VHS19. La figure 2 montre l’ŒP dans les cellules Vero à trois moments différents suivant l’infection par le VHSO. Le niveau du CPE augmente au fil du temps. Dans ce protocole, ...

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.

Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Le virus oncolytique de l’herpès simplex est une forme émergente d’immunothérapie du cancer. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination titerique du virus est essentiel pour l’utilisation dans les études expérimentales. Cette méthode est très simple et peut être facilement adoptée dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité deux pour recevoir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.La production d’un stock viral pur et de haute qualité est cruciale car il est utilisé pour étudier la réponse immunitaire anticancéreuse et pour développer une nouvelle forme d’immunothérapie du cancer à base de virus. Ce protocole peut être utilisé pour purifier n’importe quel virus de l’herpès simplex de type sauvage ou génétiquement modifié. Ce protocole devrait être facile à lire et facile à suivre pour une personne qui n’a jamais exécuté cette technique avant.Les matériaux et réactifs énumérés doivent être en place avant d’essayer cette technique pour la première fois. Commencez par laver les flacons T-150 centimètres carrés avec du DPBS de glucose deux fois élevé complété par 1% IFCS. Aspirer le DPBS et ajouter sept millilitres d’inoculum de virus par flacon.Balancer délicatement les fioles pendant cinq minutes et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à 2 heures. Ensuite, retirez l’inoculum et ajoutez 25 millilitres de DMEM complétés par 1% d’IFCS à chaque fiole. Après incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre jours, recueillir 20 millilitres du surnageant de culture de chaque fiole dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres.À l’aide d’un grattoir à cellules, grattez les cellules du fond des fioles. Ajouter environ 15 millilitres du surnageant de culture précédemment recueilli dans chaque fiole pour porter le volume à 20 millilitres, puis utiliser une pipette sérologique stérile de 10 millilitres pour laver doucement le fond des fioles plusieurs fois. Recueillir les cellules avec du milieu dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres placés sur de la glace.Centrifuger les tubes à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ressusciter soigneusement chaque pastille dans 1,25 millilitres de tampon viral, ou VB, et 1,25 millilitres de surnageant de culture précédemment recueilli. Mélanger toutes les pastilles remises en suspension dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres.Enciquez les cellules remises en suspension à l’aide de glace carbonique et d’éthanol à 100% et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Décongeler les cellules congelées précédemment cassées dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius et soniquer pendant une minute pendant trois cycles dans un bain-marie. Ajouter 175 unités de benzonase nucléase et deux microlitres de deux chlorures de magnésium millimolaires par millilitre du lysat cellulaire et du vortex.Après une incubation de 30 minutes et un bain d’eau tiède à 37 degrés Celsius, placez le tube sur de la glace. Faire tourner le lysat cellulaire à 300 fois G pendant 10 minutes. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres et ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB. Désignez-le comme granulé un.Faites tourner à nouveau le surnageant collecté à 500 fois G pendant 10 minutes et conservez le surnageant séparément dans un tube de centrifugation conique frais de 50 millilitres pour l’utiliser plus tard. Ressusciter la pastille cellulaire dans 500 microlitres de VB, en la désignant comme pastille deux. Mélanger le pastille remise en suspension un et le granulé deux dans un nouveau tube de centrifugation de 1,75 millilitre et vortex et sonique deux fois au bain-marie avant de faire tourner les tubes à 400 fois G pendant 10 minutes.Recueillir le surnageant à partir d’un tube de centrifugation de 1,7 millilitre et le combiner avec le tube de centrifugation conique de 50 millilitres précédemment collecté. Filtrez le surnageant à travers un filtre à membrane PVDF stérile de cinq micromètres dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube un. Ajoutez un millilitre de VB au tube de centrifugation de 50 millilitres, vidé après avoir filtré le surnageant de l’étape précédente, le vortex, et passez-le à travers le même filtre à membrane PVDF placé sur le tube un.Passez le filtrat du tube un à travers un filtre à membrane MCE stérile de 0,8 micromètre placé sur un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres appelé tube deux. Ajoutez un millilitre de VB au tube vidé un, vortex, et passez-le à travers le même filtre MCE placé sur le tube deux. Passez le filtrat du tube deux à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 micromètre placé sur un nouveau tube centrifuge de 50 millilitres étiqueté tube trois.Comme décrit précédemment, répétez le lavage du tube deux avec un millilitre de VB pour ajouter du filtrat au tube trois. Dans cette analyse représentative, l’effet cytopathic a pu être observé dans les cellules de Vero à 36, 48, et 72 heures d’infection d’oHSV avec l’arrondi des cellules affectées. Le niveau croissant de CPE au fil du temps est évident tel que visualisé par l’expression de mCherry.À 72 heures d’infection de poteau, des plaques virales ont été souillées avec X-gal pour visualiser l’oHSVs avec l’expression de lacZ. Il est essentiel de nettoyer doucement les cellules infectées par le virus et de laver doucement le fond du ballon pour garder intactes toutes les cellules infectées par le VHS afin d’obtenir un stock viral à titre élevé.

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un rapide, protocole simple et rentable pour la génération de donateurs issus multivirus des CTL spécifiques (rctl) pour perfusion à allogéniques greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) à risque de développer des infections à CMV, Adv ou EBV. Ce processus de fabrication est conforme aux BPF et devrait assurer la plus large mise en œuvre des cellules T immunothérapie delà des centres spécialisés.

Génération de cellules T spécifiques Multivirus pour prévenir / traiter les infections virales, après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

Les virus oncolytiques sont prometteurs pour traiter le cancer. La capacité de vérifier l'infectabilité des échantillons de tissus provenant de patients vivent avant le traitement est un avantage unique de cette approche thérapeutique. Ce protocole décrit comment traiter les tissus pour...

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Le plaquage est une méthode de routine utilisée pour quantifier les virus vivants dans une population. Bien que le plaquage soit fréquemment enseigné dans divers programmes de microbiologie avec des bactéries et des bactériophages, l’affaissement des virus des mammifères est plus complexe et prend plus de temps. Ce protocole décrit les procédures qui fonctionnent de manière fiable pour le travail régulier avec les virus de l’herpès simplex.

Affaissement des virus de l’herpès simplex

Ce protocole décrit un système in vitro permettant de modéliser l’infection lytique de novo de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi à l’aide de virions dérivés de BAC16. La méthode permet d’étudier la réplication et la dissémination virales précoces. La production de virus infectieux est quantifiée par des tests d’unités infectieuses basées sur la GFP et une PCR en temps réel des génomes viraux encapsidés.

Etablissement et quantification de l’infection lytique de novo par l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi acellulaire

Apprenez la culture, la purification et le titrage du virus oncolytique de l'herpès simplex pour la recherche préclinique en immunothérapie anticancéreuse. Cette méthode simple produit des stocks viraux de haute qualité.

Croissance, purification et titrage du virus oncolytique de l’herpès simplex

Explorer plus de vidéos