Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique qui révèle des détails moléculaires sur l’activité des ribosomes à l’intérieur de la cellule. Cette technique permet aux utilisateurs d’obtenir les informations précieuses fournies par un profil polysomique, qui n’ont pas accès à des systèmes automatisés de fractionnement de gradient. Prenez votre temps lors de la préparation des gradients et stockez les gradients dans un endroit où ils ne seront pas perturbés par un compresseur ou d’autres opérations mécaniques lorsqu’ils s’installent dans une pente linéaire.

Pour commencer, préparez des solutions mères de 7 et 47% de saccharose dans un tampon de gradient de saccharose. Filtrer stériliser les solutions de saccharose à travers un filtre de 0,22 micron. Préparer 14 millilitres de solutions de saccharose à 17, 27 et 37 % en distribuant et en mélangeant les solutions mères à 7 et 47 %.

Placez six tubes centrifuges en polypropylène dans un support de tube à essai à vue intégrale. Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace entre les tubes pour que les actions avec un tube ne perturbent pas les autres. Fixez une aiguille de calibre 22 de neuf pouces avec une pointe émoussée à une seringue de trois millilitres, et effectuez un remplissage et une distribution d’essai pour s’assurer que la seringue peut contenir la solution de saccharose sans goutte avant de mettre en place les gradients.

Ajouter deux millilitres de saccharose à 7% au fond de chaque tube de centrifugation. Ensuite, ajoutez deux millilitres du saccharose à 17% sous la solution à 7%, en positionnant l’extrémité de l’aiguille à proximité immédiate du fond du tube. Distribuez soigneusement et lentement la solution.

Répétez la procédure avec deux millilitres chacun de la solution de saccharose à 27, 37 et 47%, en veillant à ce que chaque couche se distingue de l’autre par une ligne marquant la séparation des densités. Conservez les gradients à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour leur permettre de se déposer dans un pourcentage continu et croissant de saccharose. Après la croissance et la récolte de la levure, les cellules de Saccharomyces cerevisiae remettent les cellules en suspension dans 700 microlitres réfrigérés de tampon d’extraction de polysomes.

Ajouter 100 unités d’inhibiteur de l’ARNase. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de billes de verre pré-refroidies d’une taille approximative de 425 à 600 microns. Transférer le mélange dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre avec les billes de verre et perturber les cellules de levure par une agitation vigoureuse dans un batteur à billes pendant cinq minutes.

Après avoir perturbé les cellules, clarifier le lysat par centrifugation. Déterminer la concentration de l’ARN dans le lysat clarifié en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres, à l’aide d’un système de détection d’ARN basé sur la fluorescence. Assurez-vous que la concentration d’ARN est de 0,5 à un microgramme par microlitre.

Si la concentration d’ARN est trop faible, réduire le volume du tampon d’extraction utilisé pour remettre les cellules en suspension. Chargez soigneusement le lysat sur le dessus des dégradés. Placez l’embout de la pipette contre la paroi intérieure au sommet du tube en polypropylène.

Inclinez le tube et distribuez lentement le lysat sur le dessus de la pente, en dribblant contre le mur. Placez délicatement les tubes dans les godets pré-refroidis d’un rotor de godet oscillant et centrifugez les gradients. Après la centrifugation, retirez soigneusement les tubes de centrifugation du rotor du godet oscillant et placez-les dans un support de tube.

Étiqueter les plaques de 96 puits pour stocker les fractions et prérefroidir sur de la glace. Recueillir 100 ou 200 fractions de microlitres en partant du haut du gradient, en insérant soigneusement une pointe de pipette dans le haut du gradient, et en recueillant les fractions jusqu’à ce que tout le dégradé soit aliquote. Mesurer l’absorbance de chaque fraction à 254 nanomètres avec un spectrophotomètre par rapport aux solutions de saccharose à 7 et 47% sous forme d’ébauches.

Créez le profil polysomique en traçant le nombre de fractions en fonction de l’absorbance. Trois profils polysomiques représentatifs de la levure S.Cerevisiae, sont présentés. La crête de chaque sous-unité ribosomique et pic polysomique est apparente sur chaque profil.

Un profil représentatif d’un système automatisé de fractionnement de densité est présenté ici. Ce profil a été produit à partir d’un profil d’absorbance continue lorsque le gradient de saccharose a été déplacé de bas en haut par une solution de chasse, à travers une cellule d’écoulement du détecteur et recueilli en fractions. Le profil polysomique généré par fractionnement manuel d’échantillons de 200 et 100 microlitres est présenté ici.

La chose la plus importante à retenir avec cette procédure est de ne pas perturber les gradients. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air ou perturber le gradient en distribuant la solution trop rapidement. En suivant cette procédure, l’ARN peut être extrait des gradients pour une analyse plus approfondie afin de déterminer les ARNm qui s’associent à des ribosomes actifs.