Imagerie spatio-temporelle in vivo de systèmes d’administration de médicaments oculaires à l’aide d’une microendoscopie laser confocale à fibre optique

Ce protocole facilite le dépistage de nouvelles formulations afin de mieux comprendre comment les modifications affectent leurs temps de résidence tissulaire, ce qui est essentiel dans la conception d’un système d’administration de médicaments optimal. Cette technique est non invasive et permet l’imagerie en temps réel, ce qui réduit l’utilisation excessive d’animaux pour l’échantillonnage. Les systèmes d’administration de médicaments peuvent être repensés pour l’imagerie et les applications thérapeutiques en incluant simplement le médicament thérapeutique et la fraction d’imagerie dans un nano-porteur.

Cela a des applications utiles dans le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Rasha Msallam, chercheuse principale de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, deux heures avant l’injection sous-conjonctivale, injecter à la souris par voie intraveineuse via la queue 2,5 milligrammes par kilogramme de bleu Evans, ou EB. Après avoir sédatif la souris avec 5% d’isoflurane, transférez la souris dans un cône de nez et maintenez la souris sous sédation sur un coussin chauffant.

Ensuite, coupez les moustaches près de l’œil à injecter. Instiller une goutte de solution de chlorhydrate de métamétacine à 0,5% directement sur l’œil. Ensuite, chargez une seringue en verre de 10 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 32 avec des liposomes fluorescents et assurez-vous que les bulles d’air ne sont pas présentes dans la seringue.

À l’aide d’une pince, soulevez la conjonctive et injectez lentement des liposomes dans l’espace sous-conjonctival, puis retirez l’aiguille lentement, empêchant ainsi le reflux. Assurer la formation de bleb rempli de liposomes fluorescents. Administrer une goutte d’acide fustique de 1% sur l’œil et surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience.

Allumez le système CLM. Connectez la sonde au système CLM. Choisissez le champ de vision et l’emplacement des fichiers d’acquisition à ce stade.

Ajustez l’intensité du laser pour vous assurer que la détection de fluorescence de la fluorescéine DHPE est dans la plage linéaire et gardez l’intensité cohérente pour la comparaison entre les images prises à différents moments. Une fois le système réchauffé pendant 15 minutes, étalonnez le système conformément aux instructions du fabricant à l’aide du kit d’étalonnage contenant les solutions de nettoyage, de rinçage et de fluoro-4 pour chaque laser. En bref, commencez à calibrer en immergeant la pointe pendant cinq secondes chacune dans le flacon nettoyant, puis dans le flacon de rinçage.

Laissez la pointe en l’air pour l’enregistrement en arrière-plan afin de normaliser les valeurs d’arrière-plan des différentes fibres des sondes, assurant ainsi l’uniformité de l’image. Encore une fois, immergez la pointe pendant cinq secondes dans le flacon nettoyant, puis dans le flacon de rinçage. Ensuite, immergez la pointe dans le flacon contenant du fluoro-4 488 nanomètres pendant cinq secondes pour normaliser les valeurs du signal.

Répétez l’immersion de la pointe pendant cinq secondes dans le flacon nettoyant suivi du flacon de rinçage. Gardez la pointe dans le flacon de rinçage jusqu’à ce que le signal de fluorescence enregistré à l’étape précédente disparaisse. Ensuite, transférez la pointe dans le flacon contenant du fluoro-4 660 nanomètres pour normaliser les valeurs de signal de différentes fibres de la sonde.

Après l’étalonnage, assurez-vous que la valeur est inférieure à 100 pour l’arrière-plan de la sonde. Sinon, effectuez un nettoyage répété de la sonde avec un applicateur à pointe en coton. Allumez le régulateur de température animal avec un coussin chauffant attaché et ajustez la température à 37 degrés Celsius.

Après avoir recouvert le coussin chauffant d’un drap chirurgical, fixez le cône de nez sur le coussin chauffant. Après avoir sédatif la souris à l’aide de 5% d’isoflurane dans une chambre d’induction, transférez la souris au cône de nez et maintenez la souris sous sédation sur un coussin chauffant. Ensuite, instillez une goutte de solution anesthésique de 0,5% de chlorhydrate de métamétacine sur l’œil.

Pour laver la surface oculaire et éviter la cristallisation de la lentille, gardez les yeux lubrifiés en laissant tomber quelques gouttes salines. Ensuite, faites pivoter et ajustez l’oculaire du microscope pour voir l’œil de la souris de manière ergonomique dans la mise au point directe à un grossissement de 0,67 fois. Allumez le laser et placez la sonde comme un stylo directement sur la région de l’œil à imager.

Ensuite, commencez à enregistrer l’acquisition pour observer la fluorescence dans l’œil à la région d’intérêt. Arrêtez l’enregistrement lorsque toutes les régions sont signalées et étiquetées en fonction de la carte des yeux pour connaître l’emplacement exact de la sonde dans le cadre exact. Les fichiers d’acquisition seront enregistrés automatiquement en tant que fichiers vidéo à l’emplacement précédemment choisi.

L’imagerie par fluorescence a révélé une différenciation distincte entre les régions de la sclérotique et de la cornée. Une vascularisation élevée de l’épisclére et de la conjonctive a provoqué une coloration rouge de la région de la sclérotique avec EB. La cornée, qui manque de vascularisation, semblait noire. La fluorescence de contraste des limbes et de la sclérotique a été observée dans une étude de sept jours.

Des souris témoins injectées de colorant de fluorescéine ont confirmé la spécificité de la fluorescence dérivée des liposomes. Les intensités de fluorescence étaient élevées les premier et troisième jours. La fluorescence verte proxiquait la réduction des liposomes dans les régions des limbes et des sclérotiques au fil du temps.

Les différences dans les signaux de fluorescence du premier jour post-injection au troisième jour au niveau des limbes temporaux et des limbes supérieurs n’étaient pas significatives, ce qui indique une préférence des liposomes neutres pour la région des limbes, en particulier la périphérie cornéenne. Pour les régions temporales et supérieures le premier jour post-injection, la fluorescence dans la sclérotique était six fois plus élevée que dans les limbes. Aux troisième et septième jours, les liposomes ont été significativement réduits dans la sclérotique dans les régions temporale et supérieure, attribués aux mécanismes de clairance oculaire.

La plus faible quantité de fluorescence a été détectée dans les régions nasales et inférieures, en raison de la distance par rapport au site d’injection. Il est important d’étiqueter les images de mouchetures en fonction de la carte des yeux avant l’arrêt de l’enregistrement. Gardez l’intensité laser cohérente et définissez la valeur de fond maximale pour une comparaison correcte entre différentes expériences.

Après l’identification des formulations principales, des études pharmacocinétiques et de biodistribution complètes chez l’animal peuvent être menées pour étudier la biodisponibilité du médicament et valider l’efficacité thérapeutique de leurs formulations.