Bioimpression 3D d’astrocytes corticaux murins pour l’ingénierie de tissus de type neural

La bioimpression 3D des astrocytes représente une avancée dans l’ingénierie des tissus neurologiques, permettant la biofabrication de modèles in vitro utiles pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies neurologiques. Le principal avantage de la bioimpression 3D est de biofabriquer des structures d’appoint cellulaires qui imitent les caractéristiques biochimiques et mécaniques des tissus, offrant ainsi une meilleure compréhension de la dynamique cellulaire dans la santé et la maladie. Ce protocole peut être appliqué à la biofabrication d’autres tissus mous, car il est basé sur la bio-impression 3D d’une bio-encre composée de polymères naturels et de composants de matrice extracellulaire.

Pour commencer, coupez le tissu cortical isolé de la souris euthanasiée en petits morceaux avec un micro-ciseau incurvé. Lavez les morceaux de tissu trois fois avec un millilitre de HBSS en pipetant de haut en bas. Après avoir retiré HBSS ajouté pour la troisième fois, ajouter un millilitre de 0,05% de trypsine et incuber le tissu pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Pour la dissociation mécanique des tissus, pipettez doucement le mélange de trypsine tissulaire de haut en bas 15 fois. Ensuite, transférez le mélange dissocié dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez un volume égal de FBS pour neutraliser l’activité de la trypsine. Filtrer la suspension à travers un filtre de crépine de cellule de 0,4 micromètre pour éliminer les fragments non dissociés.

Lavez le filtre avec un millilitre de milieu astrocytaire. Pelletez la suspension cellulaire filtrée par centrifugation. Après avoir éliminé le surnageant, suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture d’astrocytes.

Transférer la suspension cellulaire dans une fiole de culture T25. Constituer un volume moyen total de 3,5 millilitres et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour obtenir le fibrinogène à la concentration finale de trois milligrammes par millilitre, transférer 0,9 millilitre de 10 milligrammes par millilitre de solution de fibrinogène dans la solution de méthacryloyle de gélatine-gélatine.

Pour obtenir le photo-initiateur à la concentration finale de 0,5% poids par volume, ajouter 0,015 gramme de photo-initiateur à la solution préparée de gélatine-géthacryloyl fibrinogène. Après le vortex, maintenez la solution à 40 degrés Celsius, à l’abri de la lumière pour éviter la dégradation de l’IP. Ensuite, filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre dans un tube conique stérile de 15 millilitres.

Transférer 980 microlitres de la solution de biomatériau dans un tube conique de 15 millilitres. Pour obtenir la laminine à la concentration finale de deux microgrammes par millilitre, ajouter 20 microlitres de laminine diluée au tube contenant de la bio-encre. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas, en évitant les bulles et en maintenant la solution de bio-encre à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à être mélangée avec les cellules.

Trypsiniser les astrocytes primaires avec 0,05% de trypsine pendant 5 minutes et neutraliser l’activité de la trypsine avec FPS à un rapport de un à un. Ensuite, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 200 fois G pendant cinq minutes. Après avoir compté les cellules, transférer 1 fois 10 aux 6 cellules dans un tube conique différent et centrifuger comme démontré.

Ne laissez que 200 microlitres du surnageant dans le tube et suspendez la pastille cellulaire en tapotant doucement le fond du tube conique. Pour obtenir une concentration finale de 1 fois 10 aux 6 cellules par millilitre, transférer un millilitre de solution de gélatine-géthacryloyl fibrinogène dans le tube contenant les cellules et homogénéiser en pipetant doucement de haut en bas. Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour transférer lentement les astrocytes déposés dans une solution de bio-encre de méthacryloyl fibrinogène gélatine-gélatine dans une seringue en plastique de cinq millilitres, évitant ainsi la formation de bulles.

Connectez une aiguille émoussée stérile de calibre 22 à la seringue. Exposez la bioimprimante à la lumière UV pendant 15 minutes, puis essuyez la bioimprimante avec de l’éthanol à 70%, puis connectez la seringue à la tête d’impression de la bioimprimante et rincez manuellement la bio-encre pour éliminer les bulles restantes. Pour effectuer la bioimpression, placez à 35 millimètres le plat de culture sur la table de la bioimprimante, placez l’aiguille à 0,1 millimètre de la surface du plat de culture pour permettre le mouvement de l’aiguille et appuyez sur le bouton Imprimer.

Une fois la bioimpression terminée, assurez-vous que la seringue s’éloigne du plat et ferme le plat de culture. Placez le plat de culture sous la lumière UV pour la réticulation de gélatine méthacryloyle. Utilisez une spatule stérile pour transférer la construction bioimprimée sur une plaque de 24 puits.

Ajouter 500 microlitres de solution de chlorure de calcium de thrombine et laisser agir pendant 30 minutes pour permettre la réticulation de la fibrine. Après avoir retiré la solution de réticulation, laver la construction avec deux millilitres de PBS, puis remplacer le PBS par un millilitre de milieu de culture d’astrocytes. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et changer le milieu tous les trois jours.

Utilisez une spatule pour transférer la construction bioimprimée dans un plat de culture de 35 millimètres. Lavez la construction avec un millilitre de PBS. Déposez 100 microlitres du réactif mort vivant sur la construction et maintenez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en le protégeant de la lumière.

Après avoir retiré le réactif mort vivant, lavez la construction avec PBS comme démontré. Transférez l’échantillon dans une boîte confocale et observez les cellules de la construction sous un microscope confocal en utilisant une excitation de 488 et 570 nanomètres pour l’acquisition d’images. Après la bioimpression 3D, l’intégrité de l’échafaudage bioimprimé a été estimée et la formation d’une structure bien définie a été observée avec des cellules piégées dans le biomatériau.

Après des processus de bio-impression et de réticulation, la plupart des cellules présentaient une morphologie ronde lorsque la construction était incubée avec un milieu astrocytaire. Les échafaudages bioimprimés ont maintenu leur intégrité après sept jours d’incubation, et bien que certaines cellules rondes aient été observées, de nombreux astrocytes se sont répandus dans toute la construction, présentant une morphologie astrocytaire et une interconnexion. La viabilité cellulaire a été évaluée juste après la bioimpression et les résultats ont montré qu’à la vitesse inférieure, les cellules viables représentaient jusqu’à 74% du total des cellules, étant significativement plus élevées que les cellules bioimprimées à une vitesse plus élevée.

La viabilité des astrocytes bioimprimés a été normalisée en astrocytes cultivés en 2D et les résultats ont indiqué que le septième jour, les astrocytes bioimprimés avaient considérablement augmenté la viabilité. Immédiatement après la bioimpression, les astrocytes ont montré une morphologie ronde et un test mort vivant. Après une semaine, les astrocytes se sont répandus dans toute la construction et ont présenté une morphologie distincte des cellules, identique à la culture 2D.

Les astrocytes bioimprimés en 3D ont été caractérisés par immunofluorescence. Après sept jours d’incubation dans la construction bioimprimée, des astrocytes très denses avec une morphologie en forme d’étoile ont été observés. Les cellules astrocytaires bioimprimées ont exprimé le marqueur spécifique des astrocytes, la protéine acide fibrillaire gliale indique la rétention du phénotype astrocytaire après sept jours de bioimpression, et ces résultats indiquent que la composition de la bio-encre a fourni un microenvironnement biocompatible pour favoriser l’adhésion, la propagation et la croissance des astrocytes.

L’évaluation de gènes spécifiques et de marqueurs cellulaires expression par les astrocytes bioimprimés fournirait des preuves de la fonction de type neurochocôt, telle que la réactivité astrocytaire suivant des stimuli spécifiques. Ce protocole ouvre la voie à la biofabrication de structures neuro-semblables plus complexes composées de différents types de cellules dans des biomolécules, permettant d’imiter des niches neurogènes spécifiques.