Test humanisé de libération du médiateur comme lecture de la puissance des allergènes

Le test représente un outil de recherche important pour simuler les dégranulations des basophiles induites par la réticulation des IgE des patients et des allergènes. Ainsi, le test peut être utilisé pour imiter les réactions allergiques de type 1. Le test est robuste, reproductible et personnalisable.

De plus, il est très sensible car il peut être effectué avec de petites quantités d’allergènes recombinants ou purifiés ou même avec des extraits d’allergènes complexes. La méthode est utilisée pour diagnostiquer les allergies car elle analyse la réactivité des IgE des patients aux allergènes. Cette méthode convient également à l’analyse de la réactivité croisée et au suivi de l’efficacité du traitement ait.

Commencez par prélever des cellules Ag8 dans la fiole de culture cellulaire et transférez les cellules dans un tube de centrifugation. Adézez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes, à 250 fois g à température ambiante. Aspirer le surnageant et ressuspendez la pastille cellulaire à une concentration finale d’environ une fois 10 à la sixième cellule, par millilitre dans un milieu humanisé de cellules RBL.

Diluer les sérums humains de un à 10 dans une suspension de cellules Ag8 pour la dilution sérique finale de un à 20 dans le dosage, et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius et cinq à 7% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules RBL humanisées atteignent une confluence de 50 à 90%, aspirez soigneusement le milieu d’une fiole de culture cellulaire T-75 sans toucher les cellules RBL humanisées adhérées. Lavez les cellules deux fois en ajoutant 10 millilitres de DPBS du côté opposé de la fiole et non directement sur les cellules.

Aspirer le DPBS, ajouter cinq millilitres de trypsine-EDTA préchauffé une fois pour le détachement cellulaire et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Tapotez doucement la fiole pour détacher les cellules. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 millimètres et remplir le tube avec un milieu cellulaire RBL humanisé ou DPBS pour diluer la trypsine-EDTA.

Centrifugez les cellules à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et ressuspendez la pastille dans cinq millilitres de milieu cellulaire RBL humanisé pour le comptage cellulaire. Après avoir compté les cellules, diluer les cellules dans un milieu cellulaire RBL humanisé pour obtenir une concentration finale de deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre.

Ajouter 50 microlitres de suspension humanisée de cellules RBL, par puits, équivalant à une fois 10 à la cinquième cellule par puits dans une plaque stérile de 96 puits. Centrifuger la suspension de sérum Ag8 pré-incubée et transférer 50 microlitres de la suspension de sérum Ag8 centrifugée dans chaque puits contenant des cellules RBL humanisées, sans perturber la pastille de cellule Ag8. Utiliser des cellules nontimulées sensibilisées sans antigène comme aucun contrôle de l’antigène pour indiquer le plateau ou le fond du signal inférieur, et ne pas sensibiliser le fond et les puits de contrôle de la lyse maximale.

Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et cinq à 7% de dioxyde de carbone. Aspirer le sérum contenant le milieu cellulaire, inverser et tapoter la plaque sur le papier absorbant pour vider la plaque pour laver les cellules RBL humanisées. Lavez les cellules trois fois en ajoutant 200 microlitres de tampon de Tyrode par puits, et incubez pendant environ 30 secondes par lavage pour les deux premiers lavages.

Après avoir ajouté le tampon de Tyrode pour la troisième fois, aspirez le tampon et laissez la solution dans les puits jusqu’à ce qu’elle soit prête à ajouter la dilution de l’antigène. Transférer 100 microlitres de solution d’antigène dans chaque puits contenant les cellules RBL humanisées pré-sensibilisées, mais ne stimulent pas la lyse maximale et les cellules de fond non sensibilisées avec l’antigène. Ajouter 100 microlitres de tampon de Tyrode dans les puits de contrôle de la lyse maximale, les puits de contrôle de fond non sensibilisés et les puits sans antigène sensibilisés.

Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius et cinq à 7% de dioxyde de carbone. Traiter les puits de contrôle de la lyse maximale avec 10 microlitres de 10% de Triton X-100 par puits, et mélanger correctement pour lyser complètement les cellules pour une libération de 100% de bêta-hexosaminidase. Ajouter 50 microlitres de solution de substrat dans une nouvelle plaque non contraignante de 96 puits.

Transférer 50 microlitres de surnageant des puits de cellules RBL humanisées contenant la plaque dans la nouvelle plaque contenant la solution de substrat et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre la conversion du substrat fluorogénique. Ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt par puits et mesurer la fluorescence comme décrit dans le manuscrit textuel. La courbe en forme de cloche obtenue dans le test d’activité de la bêta-hexosaminidase, indiquant l’occupation monovalente des épitopes de l’antigène de l’immunoglobuline E en raison de l’excès d’allergène, qui inhibe la réticulation de l’immunoglobuline E allergène à des concentrations élevées d’antigène.

La concentration d’antigène nécessaire pour la libération du médiateur de la moitié maximale a été calculée à l’aide de l’analyse de régression linéaire. Le test de viabilité cellulaire a été effectué pour exclure les effets cytotoxiques dérivés du sérum sensibilisant ou de l’antigène utilisé pour la stimulation. Cinq sérums humains différents ont été utilisés pour le test d’activité de la bêta-hexosaminidase, et quatre sérums sur cinq dérivés des patients allergiques au pollen de bouleau ont répondu à la stimulation Bet v 1, démontrant que Bet v 1 est un allergène puissant responsable des symptômes allergiques médiés par l’immunoglobuline E.

La réactivité croisée de l’immunoglobuline E aux allergènes homologues a été évaluée. La réponse à Bet v 1 a été trouvée chez les deux patients, mais le patient deux a également répondu à Cor a 1. L’allergène alimentaire homologue Bet v 1, indiquant des taux plus élevés d’immunoglobuline E à réaction croisée Cor a 1 chez le patient deux.

La nature hypoallergénique des variantes mutantes des allergènes a été évaluée et comparée à leur homologue de type sauvage. La courbe de libération de la variante Bet v 1 fold s’est déplacée vers une concentration d’antigène plus élevée par rapport à l’allergène de type sauvage, ce qui a entraîné une concentration significativement plus élevée d’antigène pour provoquer la libération demi-maximale, ce qui rend le mutant moins allergique et donc un candidat pour l’immunothérapie spécifique à l’allergène. N’oubliez pas de laisser les solutions de lavage sur les cellules jusqu’à l’application de la dilution de l’antigène pour éviter que les cellules ne se dessèchent, sinon cela entraînerait une mauvaise performance du test.

Le test peut être utilisé pour de nombreuses applications différentes, y compris la normalisation de produits allergènes, en fonction de leur activité biologique, tels que des solutions de test cutané ou des extraits utilisés pour l’immunothérapie spécifique aux allergènes.