Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques

Chaque neurone du cerveau est relié aux autres cellules neuronales par environ 7 000 synapses. Sauf que ces synapses dans le cerveau des mammifères sont principalement situées sur les petites protubérances de la membrane appelées épines dendritiques. Plasticité des synapses et des épines dendritiques et similaires, fonctions cérébrales aussi importantes que les processus d’apprentissage et de mémoire.

Il est important de noter que seule la microscopie électronique donne un aperçu complet si une colonne vertébrale dendritique a une entrée postsynaptique. Diverses techniques d’imagerie dendritique des épines sont disponibles. Cependant, la microscopie électronique à balayage de face en série offre une possibilité unique d’imager un grand volume de tissu avec une haute résolution.

La technique de microscopie électronique à balayage en série par blocs nécessite un protocole spécial de préparation des échantillons qui implique un fort contraste avec les métaux lourds. Ma fixation primaire pendant la perfusion nous a permis d’utiliser les mêmes cerveaux pour la microscopie électronique éclaircie. Les souris ont été sacrifiées et perfusées avec un fixateur primaire léger.

Le cerveau a été coupé en deux et un hémisphère a été post-fixé avec un fixateur dédié à l’immunofluorescence, un cryoprotecteur, tranché à l’aide d’un cryostat et traité pour des études d’immunofluorescence. Là où l’autre hémisphère était fixé avec un fixateur de microscopie électronique, tranché avec le vibratome et préparé pour des études de microscopie électronique. Les tranches de cerveau pour les études de microscopie électronique à balayage en série ont été contrastées, à plat incorporé dans la résine, puis une région CA1 de l’hippocampe a été montée sur la broche et imagée avec le microscope électronique à balayage à base de bloc série.

La partie du protocole mise en évidence dans une boîte jaune a été présentée dans la vidéo. Prenez le tissu, qui a été fixé et coupé en 100 tranches microbiotiques et lavez-le avec un tampon de phosphate froid cinq fois pendant trois minutes chacun. Préparer un mélange un-à-un de tétroxyde d’osmium à 4 % et de ferrocyanure de potassium à 3 %.

Le produit final brunisse. Immergez les échantillons dans ce mélange. Ensuite, placez les échantillons sur la glace.

Et à partir de ce stade, il est important de les protéger de la lumière. Incubés en les agitant doucement pendant une heure. En attendant, préparez la solution TCH.

Mélanger 10 millilitres d’eau double distillée et 0,1 gramme de TCH. Placez-le dans un four réglé à 60 degrés Celsius pendant une heure. Il est important de swill la solution de temps en temps.

Lorsque vous êtes prêt, refroidissez-le à la température ambiante. Maintenant, lavez les échantillons avec de l’eau distillée double cinq fois pendant trois minutes chacun, puis immergez-les dans une solution TCH filtrée. Les tranches deviendront noires.

Incubés pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les échantillons avec de l’eau distillée deux fois pendant trois minutes chacun et incubez-les avec du tétroxyde d’osmium à 2% pendant 30 minutes, cette fois à température ambiante. Encore une fois, lavez les échantillons avec de l’eau distillée deux fois pendant trois minutes chacun et placez-les dans de l’acétate filtré à 1% ou d’amyle.

Incubés à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, commencez par la préparation du D-aspartate. Mélanger le nitrate de plomb avec une solution d’acide aspartique préchauffée à 60 degrés Celsius.

Placez le mélange dans un bain-marie réglé à 60 degrés Celsius et ajustez le pH à 5,5 avec un hydroxyde de sodium molaire. Fermez le flacon avec de l’aspartate de plomb et laissez-le à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. La solution doit être claire.

S’il devient trouble, il doit être jeté et un nouveau doit être préparé. En attendant, lavez les échantillons avec le gaz double distillé cinq fois pendant trois minutes chacun et conservez-les au four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Immergez les échantillons dans la solution d’aspartate de plomb fraîchement préparée et incubez-les dans le four réglé à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Préparez la résine époxy. Peser les ingrédients et bien mélanger la résine pendant au moins 30 minutes avant d’ajouter l’accélérateur DMP 30. Préparer le virus avec une dilution graduée de l’éthanol.

Ensuite, sortez les échantillons du four et lavez-les à nouveau avec de l’eau distillée deux fois cinq fois pendant trois minutes chacun. En attendant, mélangez la résine avec de l’éthanol à 100% dans une proportion de un à un pour obtenir la résine à 50%. Mélangez bien.

Ensuite, déshydratez les échantillons dans chaque dilution d’éthanol pendant cinq minutes. N’oubliez pas que les échantillons ne doivent jamais sécher complètement. Infiltrez d’abord les échantillons dans 50% de résine pendant 30 minutes, puis dans 100% de résine pendant une heure, puis à nouveau dans une résine fraîche à 100% pendant la nuit.

Le lendemain, placez les échantillons dans de la résine fraîche à 100% pendant une heure, puis incorporez-les entre des feuilles d’incorporation de fluoropolymères. Préparez des morceaux de feuille d’encastrement qui ont été dégraissés à l’éthanol et mettez de côté les lames de verre qui seront utilisées comme support. Placez un morceau de feuille d’encastrement sur une lame de verre, mettez-y une goutte de résine, puis transférez soigneusement l’échantillon à l’utilisation d’un bâton en bois.

Couvrez-le avec la deuxième pièce. Essayez d’éviter les bulles d’air. Soyez doux car le tissu est très fragile.

Placez soigneusement une autre lame de verre sur le dessus de la feuille d’encastrement et durcissez l’échantillon au four à 70 degrés Celsius pendant au moins 48 heures. Séparez les couches et coupez un morceau de l’échantillon incorporé avec une lame de rasoir. Transférez-le à la paraffine.

Cela minimisera le risque de perdre l’échantillon en raison de l’électrostatique. Prenez une goupille en aluminium qui a été dégraissée à l’éthanol. Mélangez bien un époxy conducteur et utilisez-en une petite quantité pour monter l’échantillon sur la broche.

Durcir l’époxy conducteur à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Coupez chaque côté du bloc d’échantillon avec le couteau à diamant, puis polissez la face du bloc jusqu’à ce que le tissu soit exposé. Broyez l’échantillon à l’épingle à l’aide de peinture conductrice et durcissez-le.

Pour minimiser la charge, les échantillons doivent également être recouverts d’une fine couche d’or ou de palladium d’or. Placez la broche avec l’échantillon dans la chambre du microscope électronique à balayage à blocs en série. Alignez l’échantillon sur le couteau, puis fermez la chambre et définissez les paramètres.

Collectez une pile d’images. En utilisant la méthode décrite, des images de tissu cérébral de souris ont été obtenues. La grande image de l’hippocampe d’une région a été prise et l’imagerie a été située au centre de la strate radiatum.

Une pile d’images a été acquise et les objets d’intérêt, tels que les épines dendritiques et les synapses, ont été segmentés. Une morphologie tissulaire de bonne qualité a été obtenue avec des membranes et des vésicules synaptiques clairement visibles et des mitochondries bien conservées. Des études immunofluorescentes sur l’anticorps PSD 95 ont confirmé que la fixation primaire légère et la fixation traditionnelle avec 4% pfa donnent des résultats comparables.

Le protocole présenté permet l’acquisition d’images de tissus cérébraux avec l’utilisation de la microscopie électronique à balayage en série par blocs, d’une morphologie tissulaire de haute qualité et de 12 membranes visibles facilitant 10 segmentations et reconstructions droites. Ma fixation primaire a permis d’utiliser les mêmes cerveaux pour l’analyse de l’immunofluorescence PSD 95 et l’imagerie par microscopie électronique des épines dendritiques. Ici, nous utilisons PSE 9, 500 bourgeonnement.

Cependant, l’autre peut également être utilisé.