Name: Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Découvrez la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l'étude des épines dendritiques dans l'hippocampus murin. Cette méthode offre une imagerie haute résolution des réseaux neuronaux et de la plasticité synaptique.

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L’imagerie SBEM, l’imagerie par microscopie optique et la préparation d’échantillons de microscopie électronique ont été réalisées à l’utilisation de l’équipement du Laboratoire d’imagerie des tissus et des fonctions qui sert d’installation centrale d’imagerie à l’Institut Nencki de biologie expérimentale.
Pour la préparation de la figure 1, l’image d’une souris (Souris_02) et un flacon de la https://smart.servier.com/ ont été utilisés.
Ce travail a été soutenu par la subvention Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) du Centre national des sciences (Pologne) attribuée à KR.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il existe de nombreuses variantes de la méthode NCMIR primaire décrite par Deerinck en 201010. Les principes de base restent les mêmes mais, selon le type de matériel étudié, de légers changements sont mis en œuvre. Il a été décrit précédemment que différentes résines peuvent être utilisées pour intégrer des spécimens pour SBEM et par exemple dans le cas des plantes, Spurr est la résine de choix en raison de sa faible viscosité qui permet une meilleure infiltration à travers les parois cellulaires...

La plupart des synapses excitatrices du système nerveux central sont situées sur des épines dendritiques - de petites protubérances d’une membrane neuronale. Ces protubérances forment des compartiments biochimiques confinés qui contrôlent la transduction du signal intracellulaire. La plasticité structurelle des épines dendritiques et des synapses est étroitement liée aux changements fonctionnels de l’efficacité synaptique qui sous-tendent des processus aussi importants que l’apprentissage et la mémoire1,2. Il est important de noter que la microscopie électronique (EM) est la seule technique qui permet de déterminer si une colonne vertébrale dendritique a une entrée présynaptique. La résolution EM est également nécessaire pour étudier des détails ultrastructuraux tels que la forme d’une densité postsynaptique (PSD), représentant une partie postsynaptique d’une synapse, ou les dimensions d’une colonne vertébrale dendritique, ainsi que la taille et la forme d’une bouton axonale. De plus, avec EM, il est possible de visualiser les synapses et leur environnement.
Grâce aux progrès des technologies d’imagerie et de calcul, il est possible de reconstruire des circuits neuronaux entiers. Les techniques de microscopie électronique volumique, telles que la microscopie électronique à transmission à section série (ssTEM), la microscopie électronique à balayage série bloc-face (SBEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) sont couramment utilisées pour les reconstructions de circuits neuronaux3.
Dans nos études, la méthode SBEM est utilisée avec succès pour étudier la plasticité structurelle des épines dendritiques et des PSD dans des échantillons de l’hippocampe de la souris et des tranches de cerveau organotypiques 4,5. Le SBEM est basé sur l’installation d’un ultramicrotome miniature à l’intérieur de la chambre de microscope électronique à balayage6,7,8,9. Le haut du bloc d’échantillon est imagé, puis l’échantillon est coupé à une profondeur spécifiée par l’ultramicrotome, révélant une nouvelle face de bloc, qui est à nouveau imagée, puis le processus est répété8. En conséquence, seule l’image d’une face de bloc est laissée tandis que la tranche qui a été coupée est perdue sous forme de débris. C’est pourquoi SBEM est appelé une technique destructrice, ce qui signifie qu’il n’est pas possible d’imager à nouveau le même endroit. Cependant, l’avantage des méthodes on-block destructrices est qu’elles ne souffrent pas de problèmes de déformation et de perte de section pouvant affecter de manière significative la qualité des données et l’analyse des données3. De plus, SBEM donne la possibilité d’imager un champ de vision relativement grand (&gt; 0,5 mm × 0,5 mm) à haute résolution3.
Pour utiliser SBEM, les échantillons doivent être préparés selon un protocole dédié et très contrasté en raison du détecteur d’électrons rétrodéclant utilisé pour l’acquisition d’images. Nous montrons ici comment effectuer la préparation des échantillons selon le protocole basé sur une procédure développée par Deerinck10 (méthode du National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR),en utilisant des taches réduites d’osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) développées dans les années 19808,11. En outre, nous introduisons une approche de fixation en deux étapes, avec une perfusion de fixation légère qui permet d’utiliser le même cerveau à la fois pour les études d’immunofluorescence avec la microscopie optique et SBEM.
Dans le protocole, un cerveau de souris est principalement fixé avec un fixateur léger, puis coupé en deux, et un hémisphère est postfixé et préparé pour l’immunofluorescence (FI), tandis que l’autre pour les études EM (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> Graphique 1. Représentation schématique du flux de travail pour la préparation des épines dendritiques pour l’analyse avec SBEM. Les souris ont été sacrifiées et perfusées avec un fixateur primaire léger. Le cerveau a été coupé en deux, et un hémisphère a été postfixé avec un fixateur dédié à l’immunofluorescence (FI), cryoprotégé, tranché à l’aide d’un cryostat et traité pour les études IF, tandis que l’autre hémisphère a été postfixé avec un fixateur EM, tranché avec le vibratome et préparé pour les études EM. Les tranches de cerveau pour les études SBEM ont été contrastées, à plat incorporé dans de la résine, puis une région CA1 de l’hippocampe a été montée sur l’épingle et imagée avec SBEM (Figure 1). La partie du protocole mise en évidence dans une boîte jaune a été présentée dans la vidéo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td><fort>Anesthésique :</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélange de kétamine/xylazine (Ketamina/Sedazin)</td><td>Biowet Pulawy, Pulawy, Pologne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique (Morbital)</td><td>Biowet Pulawy, Pulawy, Pologne</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Fixateurs :</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (GA)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, États-Unis</td><td>G5882</td><td>Grade I, 25 % en H2O, spécialement purifié pour être utilisé comme fixateur</td></tr><tr><td>d’acide chlorhydrique (HCl)</td> par microscopie <td>électroniquePOCH, Gliwice, Pologne</td><td>575283115</td><td>pur p.a.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>441244</td><td>prilled, 95</td></tr> %<tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>comprimés Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>Grade réactif S5881</td><td>, <img alt="Equation » src=">98 %, granulés ( anhydre)</td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large blunt/blunt curve ciseaux (~14,5 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro-spatule (extrémités plates doubles de 2 po, l’une arrondie, l’autre effilée à 1/8")</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Pointe d’aiguille, 15 GA, émoussée (aiguille de perfusion)</td><td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Allemagne</td><td>KD-FINE 900413</td><td>1,80 x 40 mm</td></tr><tr><td>Paire de pinces à épiler</td> <td>fines (Graefe)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>Lead Fluid</td><td>BQ80S</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en plastique</td><td>Profilab, Varsovie, Pologne</td><td>534.02</td><td>Flacons en plastique avec capuchon bleu pour le stockage des tissus, 20 ml, 31 x 48 mm</td></tr><tr><td>Ciseaux à iris droits (~9 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Préparation de tranches de cerveau pour EM : Plaque &gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12 puits</td><td>NEST, Rahway, NJ, États-Unis</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylique</td><td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre</td><td>Microscopie électronique Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72632</td><td>20 ml Flacon à scintillation, un paquet de 100</td></tr><tr><td>pipette Pasteur</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-4545</td><td>LDPE, jetable, 7,5 ml</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Wilkinson Sword, Londres, Royaume-Uni</td><td></td><td>Lames de rasoir de sécurité classiques à double tranchant</td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Royaume-Uni</td><td>N° 20</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems, Vienne, Autriche</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Préparation des tranches de cerveau pour IF :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well</td><td>plaque NEST, Rahway, NJ, États-Unis</td><td>701101</td><td></td></tr><tr><td>Criostat</td><td>Leica Microsystems, Vienne, Autriche</td><td>Leica CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Bioshop, Burlington, Canada</td><td>ETH001</td><td></td></tr><tr><td>Lame jetable à profil bas 819</td><td>Leica Biosystems Inc., États-Unis</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Royaume-Uni</td><td>n° 20</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>POCH, Gliwice, Pologne</td><td>792770426</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>POCH, Gliwice, Pologne</td><td>772090110</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation de tissus pour la cryosection, OCT-Compound</td><td>Leica Biosystems, Suisse</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Immunomarquage :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well</td><td>plate NEST, Rahway, NJ, États-Unis</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-protéine de densité post-synaptique 95</td><td>Merck-Millipore, Burlington, MA, États-Unis</td><td>MAB1598</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss, G&amp;ouml ; ttingen, Allemagne</td><td></td><td>Microscope Zeiss Spinning Disc (63 &amp; times ; objectif à huile, NA 1,4, taille de pixel 0,13 &amp; micro ; m &amp; fois ; 0,13 et micro ; m)</td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>Menzel Glaser, Braunschweig, Allemagne</td><td>B-1231</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorsion croisée élevée, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Medium de montage, avec DAPI</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AGAA00008</td><td>SuperFrost</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, États-Unis</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JWElectronic, Varsovie, Pologne</td><td>KL-942</td><td></td></tr><tr><td>TritonT X-100 Reagent Grade</td><td>Bioshop, Burlington, Canada</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>Préparation d’échantillons de microsocpy électronique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate(II) de potassium trihydraté</td><td>POCH, Gliwice, Pologne</td><td>746980113</td><td></td></tr><tr><td>Aclar 33C Film</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>50425</td><td>Feuille d’enrobage de film fluoropolymère</td></tr><tr><td>DMP-30, 2,4,6-Tris(diméthylaminométhyl)phénol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>T58203</td><td>Accélérateur de milieu d’enrobage d’époxy</td></tr><tr><td>Durcupan ACM monocomposant A, M</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>44611</td><td>Durcupan ACM monocomposant A, M résine époxy</td></tr><tr><td>Durcupan ACM monocomposant B</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>44612</td><td>Durcupan ACM monocomposant B, durcisseur 964</td></tr><tr><td>Durcupan ACM monocomposant D</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>44614</td><td>Durcupan ACM monocomposant D , plastifiant</td></tr><tr><td>Alcool éthylique absolu</td><td>POCH, Gliwice, Pologne</td><td>64-17-5</td><td>Alcool éthylique absolu pur à 99,8 % P.A.-BASIC</td></tr><tr><td>Four de laboratoire Genlab</td><td>Wolflabs, York, Royaume-Uni</td><td>Mino/18/SS</td><td>Four Genlab MINO/18/SS 18l volume, pas de circulation de ventilateur, pas d’affichage numérique, gradient de température standard, taux de récupération standard, pas de minuterie, 250&amp;deg ; C température maximale, alimentation électrique 240V</td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>A-9256</td><td>grade de réactif, <img alt="Equation » src=">98 % (HPLC)</td></tr><tr><td>Plomb (II)</td><td>nitrate Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>467790</td><td><img alt="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">99.95 % de métaux traces base</td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>75632</td><td>pour la microscopie électronique, 4 % dans H2O</td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Elmetron, Zabrze, Pologne</td><td>CP-5-5</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>BioSan, J&amp;oacute ; zef&amp;oacute ; w, Pologne</td><td>Multi Bio RS-24</td><td>rotateur Multi Bio RS-24</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S5881</td><td>qualité de réactif, <img alt="Equation » src=">98 %, granulés (anhydres)</td></tr><tr><td>Mini shaker de tournesol</td><td>Grant bio, Shepreth,UK</td><td>-3D</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>SLGP033NB</td><td>0,22 et micro ; m taille des pores</td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>88535</td><td>purum p.a., pour microscopie électronique, <img alt="Equation » src=">99.0 % (N)</td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Serva, Heidelberg, Allemagne</td><td>77870</td><td>Acétate d’uranyle&amp;middot ; 2H2O, qualité recherche</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>WSL, Swietochlowice, Pologne</td><td>LWT</td><td></td></tr><tr><td>Montage d’échantillon pour plaque de culture SBEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2782</td><td>Plaques 96 puits, fond rond, non traité</td></tr><tr><td>AM Gatan 3View pince à épiler de manipulation de talons</td><td>Micro to Nano, Haarlem, Pays-Bas Pays-Bas</td><td>50-001521</td><td></td></tr><tr><td>Jumelles</td><td>OPTA-TECH, Varsovie, Pologne</td><td>X2000</td><td></td></tr><tr><td>Colle conductrice</td><td>Chemtronics, Géorgie, USA</td><td>CW2400</td><td>conductrice eopxy</td></tr><tr><td>Gatan 3Voir l’échantillon de broches</td><td>Micro to Nano, Haarlem, Pays-Bas Pays-Bas</td><td>10-006003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>P7793</td><td>Taille du rouleau 20&amp;nbsp ; dans. &amp; fois ; 50&amp;nbsp ; ft</td></tr><tr><td>Peinture argentée conductrice Pelco</td><td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td><td>16062-15</td><td>PELCO&amp;reg ; &amp;nbsp ; Peinture argentée conductrice, lames</td></tr><tr><td>de rasoir 15g double tranchant</td><td>Microscopie électronique Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72000</td><td>Acier inoxydable « PTFE » revêtu. Marque PERSONNA .004" d’épaisseur, emballées individuellement, 250 lames dans une boîte.</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td>Sigma VP avec chambre Gatan 3View2, tension d’accélération 2,5 kV, pression variable 5 Pa, ouverture 20 &amp; micro ; m, temps d’arrêt 6 &amp;micro ; s, épaisseur de la tranche 60 nm, grossissement 15 000 x, résolution de l’image 2048 x 2048 pixels, taille de pixel 7,3 nm</td></tr><tr><td>trim 90&amp;deg ; couteau diamanté</td><td>Diatome Ltd., Nidau, Suisse</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems, Vienne, Autriche</td><td>Leica ultracutR</td><td></td></tr><tr><td>Tutoriels sur la page web</td><td></td><td></td><td>du logiciel</td></tr><tr><td>FijiJ</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopie Navigateur d’images</td><td>http://mib.helsinki.fi/</td><td></td> <td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td></tr><tr><td>Reconstruire</td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td><td></td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td></tr><tr><td>Animaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris</td><td>Adulte Enfant de 3 mois et&amp;nbsp ; 20&amp;plus ; 1&amp;nbsp ; mois&amp;nbsp ; femelle&amp;nbsp ; Des souris Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng et al., 2000) qui expriment la GFP dans une population peu distribuée de neurones glutamatergiques. Les animaux ont été élevés en tant qu’hétérozygotes avec le fond C57BL/6J dans la maison des animaux de l’Institut Nencki de biologie expérimentale.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie électronique à balayage en bloc en série (sbem) pour l’étude des épines dendritiques

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

La microscopie électronique tridimensionnelle (3D EM) donne la possibilité d’analyser les paramètres morphologiques des épines dendritiques avec une résolution à l’échelle nanométrique. En outre, certaines caractéristiques des épines dendritiques, telles que le volume de la colonne vertébrale et la densité post-synaptique (PSD) (représentant la partie post-synaptique de la synapse), la présence de terminal présynaptique et le réticulum endoplasmique lisse ou la forme atypique de PSD (par exemple, les épines multi-innervées), ne peuvent être observées qu’avec l’EM 3D. En utilisant la microscopie électronique à balayage série bloc-face (SBEM), il est possible d’obtenir des données 3D EM plus facilement et de manière plus reproductible que lors de la section série traditionnelle. Nous montrons ici comment préparer des échantillons d’hippocampe de souris pour l’analyse SBEM et comment ce protocole peut être combiné avec une étude d’immunofluorescence des épines dendritiques. La perfusion de fixation légère nous permet d’effectuer des études d’immunofluorescence avec microscopie optique sur une moitié du cerveau, tandis que l’autre moitié a été préparée pour SBEM. Cette approche réduit le nombre d’animaux à utiliser pour l’étude.

En utilisant la méthode décrite ci-dessus à contraste élevé, des images de bonne résolution du tissu cérébral de la souris peuvent être obtenues. Un large champ de vision fourni par la technique SBEM facilite la sélection précise de la région d’intérêt. La grande image de la région CA1 de l’hippocampe a été prise pour mesurer la longueur de la couche radiale (SR)(Figure 2A)et pour fixer l’imagerie précisément au centre (Figure 2B). Ensuite, la pile d’im...

La microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) est appliquée pour imager et analyser les épines dendritiques de l’hippocampe murin.

Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Chaque neurone du cerveau est relié aux autres cellules neuronales par environ 7 000 synapses. Sauf que ces synapses dans le cerveau des mammifères sont principalement situées sur les petites protubérances de la membrane appelées épines dendritiques. Plasticité des synapses et des épines dendritiques et similaires, fonctions cérébrales aussi importantes que les processus d’apprentissage et de mémoire.Il est important de noter que seule la microscopie électronique donne un aperçu complet si une colonne vertébrale dendritique a une entrée postsynaptique. Diverses techniques d’imagerie dendritique des épines sont disponibles. Cependant, la microscopie électronique à balayage de face en série offre une possibilité unique d’imager un grand volume de tissu avec une haute résolution.La technique de microscopie électronique à balayage en série par blocs nécessite un protocole spécial de préparation des échantillons qui implique un fort contraste avec les métaux lourds. Ma fixation primaire pendant la perfusion nous a permis d’utiliser les mêmes cerveaux pour la microscopie électronique éclaircie. Les souris ont été sacrifiées et perfusées avec un fixateur primaire léger.Le cerveau a été coupé en deux et un hémisphère a été post-fixé avec un fixateur dédié à l’immunofluorescence, un cryoprotecteur, tranché à l’aide d’un cryostat et traité pour des études d’immunofluorescence. Là où l’autre hémisphère était fixé avec un fixateur de microscopie électronique, tranché avec le vibratome et préparé pour des études de microscopie électronique. Les tranches de cerveau pour les études de microscopie électronique à balayage en série ont été contrastées, à plat incorporé dans la résine, puis une région CA1 de l’hippocampe a été montée sur la broche et imagée avec le microscope électronique à balayage à base de bloc série.La partie du protocole mise en évidence dans une boîte jaune a été présentée dans la vidéo. Prenez le tissu, qui a été fixé et coupé en 100 tranches microbiotiques et lavez-le avec un tampon de phosphate froid cinq fois pendant trois minutes chacun. Préparer un mélange un-à-un de tétroxyde d’osmium à 4 % et de ferrocyanure de potassium à 3 %.Le produit final brunisse. Immergez les échantillons dans ce mélange. Ensuite, placez les échantillons sur la glace.Et à partir de ce stade, il est important de les protéger de la lumière. Incubés en les agitant doucement pendant une heure. En attendant, préparez la solution TCH.Mélanger 10 millilitres d’eau double distillée et 0,1 gramme de TCH. Placez-le dans un four réglé à 60 degrés Celsius pendant une heure. Il est important de swill la solution de temps en temps.Lorsque vous êtes prêt, refroidissez-le à la température ambiante. Maintenant, lavez les échantillons avec de l’eau distillée double cinq fois pendant trois minutes chacun, puis immergez-les dans une solution TCH filtrée. Les tranches deviendront noires.Incubés pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les échantillons avec de l’eau distillée deux fois pendant trois minutes chacun et incubez-les avec du tétroxyde d’osmium à 2% pendant 30 minutes, cette fois à température ambiante. Encore une fois, lavez les échantillons avec de l’eau distillée deux fois pendant trois minutes chacun et placez-les dans de l’acétate filtré à 1% ou d’amyle.Incubés à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, commencez par la préparation du D-aspartate. Mélanger le nitrate de plomb avec une solution d’acide aspartique préchauffée à 60 degrés Celsius.Placez le mélange dans un bain-marie réglé à 60 degrés Celsius et ajustez le pH à 5,5 avec un hydroxyde de sodium molaire. Fermez le flacon avec de l’aspartate de plomb et laissez-le à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. La solution doit être claire.S’il devient trouble, il doit être jeté et un nouveau doit être préparé. En attendant, lavez les échantillons avec le gaz double distillé cinq fois pendant trois minutes chacun et conservez-les au four à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Immergez les échantillons dans la solution d’aspartate de plomb fraîchement préparée et incubez-les dans le four réglé à 60 degrés Celsius pendant 20 minutes.Préparez la résine époxy. Peser les ingrédients et bien mélanger la résine pendant au moins 30 minutes avant d’ajouter l’accélérateur DMP 30. Préparer le virus avec une dilution graduée de l’éthanol.Ensuite, sortez les échantillons du four et lavez-les à nouveau avec de l’eau distillée deux fois cinq fois pendant trois minutes chacun. En attendant, mélangez la résine avec de l’éthanol à 100% dans une proportion de un à un pour obtenir la résine à 50%. Mélangez bien.Ensuite, déshydratez les échantillons dans chaque dilution d’éthanol pendant cinq minutes. N’oubliez pas que les échantillons ne doivent jamais sécher complètement. Infiltrez d’abord les échantillons dans 50% de résine pendant 30 minutes, puis dans 100% de résine pendant une heure, puis à nouveau dans une résine fraîche à 100% pendant la nuit.Le lendemain, placez les échantillons dans de la résine fraîche à 100% pendant une heure, puis incorporez-les entre des feuilles d’incorporation de fluoropolymères. Préparez des morceaux de feuille d’encastrement qui ont été dégraissés à l’éthanol et mettez de côté les lames de verre qui seront utilisées comme support. Placez un morceau de feuille d’encastrement sur une lame de verre, mettez-y une goutte de résine, puis transférez soigneusement l’échantillon à l’utilisation d’un bâton en bois.Couvrez-le avec la deuxième pièce. Essayez d’éviter les bulles d’air. Soyez doux car le tissu est très fragile.Placez soigneusement une autre lame de verre sur le dessus de la feuille d’encastrement et durcissez l’échantillon au four à 70 degrés Celsius pendant au moins 48 heures. Séparez les couches et coupez un morceau de l’échantillon incorporé avec une lame de rasoir. Transférez-le à la paraffine.Cela minimisera le risque de perdre l’échantillon en raison de l’électrostatique. Prenez une goupille en aluminium qui a été dégraissée à l’éthanol. Mélangez bien un époxy conducteur et utilisez-en une petite quantité pour monter l’échantillon sur la broche.Durcir l’époxy conducteur à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Coupez chaque côté du bloc d’échantillon avec le couteau à diamant, puis polissez la face du bloc jusqu’à ce que le tissu soit exposé. Broyez l’échantillon à l’épingle à l’aide de peinture conductrice et durcissez-le.Pour minimiser la charge, les échantillons doivent également être recouverts d’une fine couche d’or ou de palladium d’or. Placez la broche avec l’échantillon dans la chambre du microscope électronique à balayage à blocs en série. Alignez l’échantillon sur le couteau, puis fermez la chambre et définissez les paramètres.Collectez une pile d’images. En utilisant la méthode décrite, des images de tissu cérébral de souris ont été obtenues. La grande image de l’hippocampe d’une région a été prise et l’imagerie a été située au centre de la strate radiatum.Une pile d’images a été acquise et les objets d’intérêt, tels que les épines dendritiques et les synapses, ont été segmentés. Une morphologie tissulaire de bonne qualité a été obtenue avec des membranes et des vésicules synaptiques clairement visibles et des mitochondries bien conservées. Des études immunofluorescentes sur l’anticorps PSD 95 ont confirmé que la fixation primaire légère et la fixation traditionnelle avec 4% pfa donnent des résultats comparables.Le protocole présenté permet l’acquisition d’images de tissus cérébraux avec l’utilisation de la microscopie électronique à balayage en série par blocs, d’une morphologie tissulaire de haute qualité et de 12 membranes visibles facilitant 10 segmentations et reconstructions droites. Ma fixation primaire a permis d’utiliser les mêmes cerveaux pour l’analyse de l’immunofluorescence PSD 95 et l’imagerie par microscopie électronique des épines dendritiques. Ici, nous utilisons PSE 9, 500 bourgeonnement.Cependant, l’autre peut également être utilisé.

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Prenez une section fixe de tissu cérébral cortical de souris présentant des axones et des dendrites neuronaux. Les dendrites possèdent des protubérances, appelées épines dendritiques, qui forment des synapses avec des axones. Incuber le tissu avec du ferrocyanure d’osmium, qui se lie aux lipides, suivi d’une autre application d’osmium, qui améliore le contraste structurel pour l’imagerie. Teinture avec un composé de métal lourd qui se lie aux macromolécules et améliore le contraste. Déshydrater...

Microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés pour la reconstruction 3D de neurones liés synaptiquement

Source : Pekarek, B. T., et. al., Imagerie et quantification des dendrites neuronales intactes via le nettoyage tissulaire CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation, l’imagerie et l’analyse d’un cerveau de souris dégagé pour examiner les arborescences dendritiques, la morphologie de la colonne vertébrale et la distribution neuronale à l’aide de techniques de microscopie confocale et de reconstruction 3D.

Imagerie par microscopie confocale d’arborescences dendritiques intactes et de la morphologie de la colonne vertébrale dans le cerveau d’une souris dégagée

Source : Mukherjee, K., et. al. Analyse des mitochondries cérébrales à l’aide de la microscopie électronique à balayage en série Block-face. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la préparation, l’imagerie et l’analyse du tissu cérébral de souris à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face de bloc en série (SBFSEM) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale, permettant une cartographie précise de leur morphologie et de leur distribution spatiale dans les compartiments...

 Imagerie des mitochondries neuronales à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face carrée en série

Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

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Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

La visualisation et l’analyse mitochondriales à partir de tissus cérébraux de mammifères constituent une tâche difficile. Ici, nous décrivons comment l’analyse de reconstruction tridimensionnelle (3D) de la microscopie électronique à balayage en série (SBFSEM) peut être utilisée pour mieux comprendre l’analyse morphologique et volumétrique de cet organite générateur d’énergie critique.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

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