Name: Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Apprenez la transformation germinale hyperactive chez Spodoptera frugiperda en utilisant le système piggyBac. Cette méthode améliore l'efficacité de transformation pour la génomique fonctionnelle des insectes ravageurs.

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La recherche rapportée est soutenue par la National Science Foundation I / UCRC, le Center for Arthropod Management Technologies, sous le numéro de subvention IIP-1821936 et par des partenaires de l’industrie, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 et le National Institute of Food and Agriculture, DÉPARTEMENT DE L’Agriculture des États-Unis (2019-67013-29351 et 2353057000).

1. Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase
REMARQUE: La séquence de codage complète de la séquence hyPBase a été synthétisée et insérée dans un vecteur pTD1-Cas9 (voir la table des matériaux)pour produire la construction pTD1-hyPBase, qui contient une cassette exprimant hyPBase, promoteur T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). La séquence complète de la construction pTD1-hyPBase est fournie dans le matériel supplémentaire.
<ol><li>Préparation du gabarit pour la synthèse in vitro<ol>
<li>Effectuez une réaction PCR pour amplifier la cassette exprimant hyPBase à l’aide d’un apprêt avant, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', et d’un apprêt inverse 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polymérase haute fidélité et plasmide pTD1-hyPBase comme modèle. REMARQUE: La réaction pcR (volume final de 50 μL) contient 5,0 μL de tampon de réaction 10x, 4,0 μL de triphosphate désoxynucléoside de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmide (50 μg / μL), 1,0 μL de polymérase haute fidélité, 1,0 μL chacun de 10 amorces avant et arrière et 33 μL d’eau sans nucléase. Les réglages étaient les suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 15 s et 68 °C pendant 2 min.</li>
		<li>Vérifiez le produit PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V dans un tampon frais d’acide tétraacétique tris-acétate-éthylènediamine (TAE) pendant 30 min et purifiez le produit avec le kit d’extraction en gel. REMARQUE: N’utilisez pas le kit de purification du produit PCR. Même une quantité infime du plasmide pTD1-hyPBase diminue considérablement l’efficacité de la synthèse in vitro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase à l’aide d’un kit commercial<ol>
<li>Décongelez complètement les réactifs congelés, conservez l’enzyme et 2x solution NTP/CAP sur la glace, et laissez le tampon de réaction 10x décongelé à température ambiante.</li>
		<li>Assembler la réaction à température ambiante en ajoutant les composants suivants : 2x solution NTP/CAP : 10 μL ; 10x Tampon de réaction: 2 μL; ADN modèle: 0,1-0,2 μg; Mélange enzymatique: 2 μL; Eau sans nucléase jusqu’à 20 μL.</li>
		<li>Bien mélanger les réactifs en pipetant doucement le mélange de haut en bas et incuber à 37 °C pendant 2-4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récupération de l’ARNm synthétisé par précipitation de chlorure de lithium<ol>
<li>Ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl, bien mélanger en agitant le tube, puis maintenir à -20 °C pendant ≥ 30 min.</li>
		<li>Centrifugez à 4 °C pendant 15 min à la vitesse maximale et retirez soigneusement le surnageant.</li>
		<li>Lavez la pastille une fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %, recentrifugez et retirez soigneusement le surnageant.</li>
		<li>Sécher la pastille à température ambiante pendant 1 à 2 min, puis la remettre en suspension avec 20 à 40 μL d’eau sans nucléase.</li>
		<li>Diluer 1 μL de solution d’ARNm avec 9 μL d’eau sans nucléase. Prendre 2 μL pour déterminer la concentration d’ARNm et utiliser 8 μL pour vérifier la qualité de l’ARNm sur un gel d’agarose à 1 % à 100 V dans un tampon TAE frais pendant 40 min.</li>
		<li>Aliquoter la solution d’ARNm et conserver congelé à -70 °C jusqu’à un an. REMARQUE: Ne pas sécher complètement la pastille d’ARNm; il peut être plus difficile de le dissoudre dans l’eau.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Microinjection
<ol><li>Collecte d’œufs<ol>
<li>Placez 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.</li>
		<li>Le jour 2 après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit.</li>
		<li>Le jour 3 après l’éclosion, transférez les adultes de l’étape 2.1.2 dans un endroit sombre. Prélever les embryons dans les 2 heures suivant la ponte.</li>
		<li>Ajoutez des gouttes d’eau sur le morceau d’une serviette en papier avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre. Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuration de la micro-injection<ol>
<li>Injecter un mélange d’un plasmide transgénique exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) (200 ng/ μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) et de l’eau distillée stérile dans les œufs, en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé (voir la table des matériaux).</li>
		<li>Conserver les œufs injectés à 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.</li>
		<li>Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au début du stade du3ème stade (~ 6 mm de longueur et la couleur du corps devient noire).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dépistage par fluorescence et croisement génétique
<ol><li>Recueillez les nymphes et placez ~150 nymphes femelles et ~150 nymphes mâles dans une cage de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Suspendez plusieurs morceaux d’essuie-tout (~30 cm x 15 cm) dans la cage pour ramasser les œufs.</li>
	<li>Recueillez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs à 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.</li>
	<li>Gardez les larves de nouveau-nés à 4 °C pendant 5 min pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée.</li>
	<li>Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés sous un stéréomicroscope à fluorescence. Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal en ~ 2 semaines à 27 ± 1 ° C et séparez-les par sexe en fonction des différences de phénotype au niveau des segments ventraux de l’abdomen. REMARQUE: La nymphe femelle a une ouverture génitale en forme de fente sur le huitième segment abdominal et les marges céphaliques des neuvième et dixième segments se courbant vers l’ouverture génitale. L’ouverture génitale de la nymphe mâle présente une légère élévation sur le neuvième segment abdominal.</li>
	<li>Placez les nymphes EGFP positives et les nymphes de type sauvage du sexe opposé dans un rapport mâle/femelle de 1:1 dans une cage. Sib-croiser les adultes exprimant l’EGFP pour produire les générations suivantes.</li>
</ol>4. Détection par PCR de l’insertion transgénique
<ol><li>Extraire l’ADN génomique des larves individuelles de type sauvage et EGFP positif à l’aide de tout kit commercial d’extraction d’ADN génomique en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Effectuer une réaction de PCR en utilisant l’ADN génomique comme modèle; un amorce avant, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttctc-3' situé dans la région promotrice ie1; et un amorce inverse, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situé dans la région EGFP du vecteur de transformation.</li>
	<li>Configurez chaque réaction de PCR (volume final de 40 μL) pour contenir 20 μL du mélange de polymérase, 1,0 μL d’ADN génomique (40 μg/μL), 1,0 μL chacun des amorces avant et arrière de 10 μM et 17 μL d’eau sans nucléase. Utilisez les réglages suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 95 °C pendant 20 s, 56 °C pendant 20 s et 68 °C pendant 40 s.</li>
	<li>Vérifiez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V pendant 30 min.</li>
</ol>5. Détermination du site d’insertion transgénique
<ol><li>Effectuer une PCR TAIL à haute efficacité en utilisant l’ADN génomique comme modèle pour déterminer le site d’intégration de l’insertion du transgène chez les insectes EGFP positifs.<ol>
<li>Effectuer les réactions PCR en suivant les étapes décrites ailleurs9.<ol>
<li>Utilisez trois amorces, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', et P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgcgct-3', qui sont spécifiques au vecteur piggyBac, dans les 3 cycles de réaction PCR, respectivement.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Séquencez les produits PCR finaux pour déterminer le site d’intégration.</li>
</ol>

<ol><li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+analysis+unveils+population+evolution+and+development+of+pesticide+resistance+in+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda.</a> Protein Cell. , (2020).</li>
<li>Montezano, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plants+of+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas.</a> African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+ecdysone+oxidase+impairs+tissue+degeneration+in+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).</li>
<li>Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+sexing+system+for+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29+based+on+female-specific+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transformation+with+piggyBac%3A+getting+the+number+of+injections+just+right%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right.</a> Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Otte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+transformation+rates+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving genetic transformation rates in honeybees.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).</li>
<li>Eckermann, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+transposase+improves+transformation+efficiency+in+diverse+insect+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).</li>
<li>Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+systemic+RNA+interference+defective+protein+1+enhances+RNAi+efficiency+in+a+lepidopteran+insect%2C+the+fall+armyworm%2C+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner.</a> RNA Biology. , 1-9 (2020).</li>
<li>Liu, Y. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+thermal+asymmetric+interlaced+PCR+for+amplification+of+unknown+flanking+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.</a> Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Xu, H., O'Brochta, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+technologies+for+genetically+manipulating+the+silkworm+Bombyx+mori%2C+a+model+Lepidopteran+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect.</a> Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).</li>
<li>Wu, S. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+is+a+flexible+and+highly+active+transposon+as+compared+to+sleeping+beauty%2C+Tol2%2C+and+Mos1+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+Drosophila+melanogaster+with+the+piggyBac+transposon+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector.</a> Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).</li>
<li>Dreyfus, M., Régnier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28A%29+tail+of+mRNAs%3A+bodyguard+in+eukaryotes%2C+scavenger+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria.</a> Cell. 111 (5), 611-613 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le faible taux de transposition et la difficulté d’administrer des composants transgéniques dans des embryons frais limitent le succès de la transformation de la lignée germinale chez de nombreux insectes non modèles, en particulier ceux de l’ordre, les lépidoptères. Pour augmenter le taux de transformation de la lignée germinale, une version hyperactive de la transposase piggyBac la plus utilisée (hyPBase) a été développée7,10. À ce jour, la transformat...

La chenille légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,est originaire des régions tropicales et subtropicales d’Amérique. Actuellement, il s’agit d’un insecte herbivore dévastateur dans plus de 100 pays à travers le monde1. Les larves de FAW se nourrissent de plus de 350 plantes hôtes, y compris d’importantes cultures vivrières de base2. La forte capacité de migration des adultes FAW contribue à sa récente propagation rapide des Amériques à d’autres endroits1,2. En conséquence, cet insecte menace maintenant la sécurité alimentaire à l’échelle internationale. L’application de nouvelles technologies peut faciliter les études avancées sur la FAW et fournir de nouvelles stratégies pour lutter contre ce ravageur.
La transformation de la lignée germinale des insectes a été utilisée pour étudier la fonction des gènes et générer des insectes transgéniques à utiliser dans le contrôle génétique3,4. Parmi les différentes méthodes utilisées pour réaliser la transformation génétique chez les insectes, la méthode à base d’éléments piggyBac est la méthode la plus utilisée5. Cependant, en raison du faible taux de transposition, il est encore difficile de procéder à la transgénèse chez les insectes non modèles. Récemment, une version hyperactive de la transposase piggyBac (hyPBase) a été développée6,7. La transformation de la lignée germinale a été réalisée dans FAW récemment8, qui est le premier rapport qui a utilisé l’hyPBase chez les insectes lépidoptères. Dans ce rapport, des informations détaillées sur l’utilisation de l’ARNm hyPBase dans la génération de FAW transgénique sont décrites. La méthode décrite ici pourrait être appliquée pour réaliser la transformation d’autres insectes lépidoptères.

<table><tbody><tr><td>Rouleaux de coton dentaire 1,5</td>" <td>PlastCare USA</td><td>8542025591</td><td>REARING</td></tr><tr><td>1 oz Couvercles de tasse à soufflé</td><td>DART</td><td>PL1N</td><td></td></tr><tr><td>1 oz Tasses à soufflé</td><td>DART</td><td>P100N</td><td>REARING</td></tr><tr><td>48 oz Contenants de charcuterie en plastique</td><td>Genpack</td><td>AD48</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Ensemble de filtres supplémentaires (vert)</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-BLFS-GR</td><td>CRIBLAGE</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>BF-100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>SCREENING</td></tr><tr><td>Pince poids plume</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Gutter Guard</td><td>ThermWell Products</td><td>VX620</td><td>REARING</td></tr><tr><td>Inversé Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>INJECTION Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>16004-22</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>NightSea Full System</td><td>NightSea LLC</td><td>SFA-RB-DIM</td><td>CRIBLAGE</td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td>AWG/ Scott-Gross</td><td>NI 225</td><td>INJECTION</td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>Bounty</td><td>&nbsp ; 43217-45074</td><td>ÉLEVAGE</td></tr><<tr><td>em>Spodoptera frugiperda Régime artificiel</td><td>Southland Products, Inc</td><td>N/A [Demande d’espèce/quantité]</td><td>ÉLEVAGE</td></tr><tr><td>Spodoptera frugiperda Oeufs</td><td>Benzon Research, Inc</td><td>N/A [Demande d’espèce/quantité]</td><td>ÉLEVAGE Mélange de</td></tr><tr><td>polymérase</td> <td>Taq MasterMix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, spodoptera frugiperda

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

L’insertion stable de cargaisons génétiques dans les génomes d’insectes à l’aide d’éléments transposables est un outil puissant pour les études génomiques fonctionnelles et l’élaboration de stratégies de lutte génétique contre les ravageurs. L’élément transposable le plus utilisé dans la transformation des insectes est piggyBac, et la transformation germinale à base de piggyBaca été menée avec succès chez des insectes modèles. Cependant, il est toujours difficile d’utiliser cette technologie dans des insectes non modèles qui incluent des ravageurs agricoles. Cet article rend compte de la transformation germinale d’un ravageur agricole mondial, la légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,en utilisant la transposase hyperactive piggyBac (hyPBase).
Dans ce travail, l’ARNm hyPBase a été produit et utilisé à la place du plasmide auxiliaire dans les microinjections embryonnaires. Ce changement a conduit à la génération réussie de FAW transgénique. En outre, les méthodes de dépistage des animaux transgéniques, la détection rapide de l’insertion de transgènes par PCR et la détermination du site d’intégration par PCR entrelacée asymétrique thermique (TAIL-PCR) sont également décrites. Ainsi, cet article présente un protocole pour produire du FAW transgénique, qui facilitera la transgénèse à base de piggyBacchez le FAW et d’autres insectes lépidoptères.

Une construction pour l’expression du promoteur T7 contenant de l’hyPBase : polyhédrine-5'UTR : hyPBase : polyhédrine-3'UTR : le signal poly(A) a été généré (Figure 1A) et amplifié sous forme de fragment de PCR d’environ 2,2 kb pour synthétiser l’ARNm hyPBase in vitro (Figure 1B). Ensuite, l’ARNm hyPBase a été produit et soumis à l’électrophorèse sur gel d’agarose. L’ARNm de la taille attendue (bande d’environ 1,1 kb) a été détecté sur un gel d’agarose ...

Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.

Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Ce protocole montre la production de légionnaire d’automne transgénique à l’aide d’un système de transformation basé sur piggyBac. Nous espérons que ces méthodes bénéficieront à l’amélioration de la transformation, non seulement chez la chenille légionnaire d’automne, mais aussi chez les insectes lépidoptères. La méthode décrite ici rend efficace la transformation germinale des insectes nuisibles lépidoptères.La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Xien Chen, boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Commencez par placer 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Le deuxième jour après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit. Le troisième jour après l’éclosion, transférez les adultes dans un endroit sombre.Prélever les embryons dans les deux heures suivant la surposition. Ajoutez des gouttes d’eau au morceau de l’essuie-tout avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre.Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection. Injecter un mélange de 200 nanogrammes par microlitre de plasmide exprimant l’EGFP à base de piggyBac, de 200 nanogrammes par microlitre d’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac et d’eau distillée stérile dans les œufs en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé. Conservez les œufs injectés à 27 plus ou moins un degré Celsius, 60 plus ou moins 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au stade précoce du caillé et de l’étoile. Recueillez les nymphes et placez environ 150 nymphes femelles et 150 nymphes mâles dans une cage. Accrochez plusieurs morceaux d’essuie-tout de 30 centimètres sur 15 centimètres dans la cage pour ramasser les œufs.Ramassez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs dans des conditions appropriées jusqu’à l’éclosion. Gardez les larves de nouveau-nés à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée. Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés au stéréomicroscope à fluorescence.Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal, en environ deux semaines à 27 plus ou moins un degré Celsius. L’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac synthétisé in vitro a été détecté à l’aide d’un gel d’agarose à 1 %. Les embryons injectés par PDS ne montraient pas de signal EGFP, tandis que les embryons injectés de plasmide exprimant l’EGFP et d’ARNm hyperactif de transposase piggyBac présentaient une fluorescence EGP, indiquant que la construction de piggyBac était réussie.Les larves de G1 obtenues à partir d’œufs résultant d’un auto-croisement d’adultes G0 ont montré un fort signal EGFP. Un fragment contenant le promoteur et le fragment EGFP a été amplifié avec succès en utilisant l’ADN génomique isolé des larves EGFP positives comme modèle. Cependant, le même fragment n’a pas été détecté lorsque l’ADN génomique a été isolé des larves de type sauvage comme modèle.Les œufs pour la microinjection doivent être aussi frais que possible et doivent toujours être conservés sur de la glace avant la microinjection pour ralentir leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour répondre à des questions en génomique fonctionnelle des insectes nuisibles et développer des méthodes de contrôle génétique pour ce ravageur mondial.

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Des vers transgéniques sont couramment utilisés...

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

Dans les organismes modèles, la transgénèse permet de manipuler les fonctions des gènes tandis ARNi peut knockdown transcrits d'ARNm spécifiques 1-2. Ce protocole vise à illustrer les techniques nécessaires pour introduire de l'ADN transmis de façon stable et transitoire ARN double brin dans le nématode...

ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

L'imagerie de la morphogenèse des embryons d'insectes avec la microscopie de fluorescence à base de feuille de lumière est devenu état de la technique. Ce protocole décrit et compare trois techniques de montage appropriées pour les embryons Tribolium castaneum, introduit deux nouvelles lignées transgéniques sur mesure bien adapté pour l' imagerie en direct, discute des contrôles de qualité essentiels et indique les limites expérimentales actuelles.

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

Ici, nous présentons un protocole pour injecter des œufs de cricket, une technique qui sert de méthode fondamentale dans de nombreuses expériences dans le cricket, y compris, mais sans s'y limiter, l'interférence de l'ARN et la manipulation génomique.

Injection d'œufs Gryllus bimaculatus

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.

Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)

La boîte à outils génomique fonctionnelle pour les nématodes parasites Strongyloides stercoralis et Strongyloides ratti comprend la transgénèse, la mutagénèse médiée par CRISPR / Cas9 et l’ARNi. Ce protocole montrera comment utiliser la microinjection intragonadienne pour introduire des transgènes et des composants CRISPR dans S. stercoralis et S. ratti.

Génération de transgéniques et de Knockouts chez les espèces de strongyloïdes par microinjection

Apprenez la transformation germinale hyperactive chez Spodoptera frugiperda en utilisant le système piggyBac. Cette méthode améliore l'efficacité de transformation pour la génomique fonctionnelle des insectes ravageurs.

Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda

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