Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda
23 septembre 2021
Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.
Ce protocole montre la production de légionnaire d’automne transgénique à l’aide d’un système de transformation basé sur piggyBac. Nous espérons que ces méthodes bénéficieront à l’amélioration de la transformation, non seulement chez la chenille légionnaire d’automne, mais aussi chez les insectes lépidoptères. La méthode décrite ici rend efficace la transformation germinale des insectes nuisibles lépidoptères.
La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Xien Chen, boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Commencez par placer 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.
Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Le deuxième jour après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit. Le troisième jour après l’éclosion, transférez les adultes dans un endroit sombre.
Prélever les embryons dans les deux heures suivant la surposition. Ajoutez des gouttes d’eau au morceau de l’essuie-tout avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre.
Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection. Injecter un mélange de 200 nanogrammes par microlitre de plasmide exprimant l’EGFP à base de piggyBac, de 200 nanogrammes par microlitre d’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac et d’eau distillée stérile dans les œufs en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé. Conservez les œufs injectés à 27 plus ou moins un degré Celsius, 60 plus ou moins 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au stade précoce du caillé et de l’étoile. Recueillez les nymphes et placez environ 150 nymphes femelles et 150 nymphes mâles dans une cage. Accrochez plusieurs morceaux d’essuie-tout de 30 centimètres sur 15 centimètres dans la cage pour ramasser les œufs.
Ramassez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs dans des conditions appropriées jusqu’à l’éclosion. Gardez les larves de nouveau-nés à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée. Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés au stéréomicroscope à fluorescence.
Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal, en environ deux semaines à 27 plus ou moins un degré Celsius. L’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac synthétisé in vitro a été détecté à l’aide d’un gel d’agarose à 1 %. Les embryons injectés par PDS ne montraient pas de signal EGFP, tandis que les embryons injectés de plasmide exprimant l’EGFP et d’ARNm hyperactif de transposase piggyBac présentaient une fluorescence EGP, indiquant que la construction de piggyBac était réussie.
Les larves de G1 obtenues à partir d’œufs résultant d’un auto-croisement d’adultes G0 ont montré un fort signal EGFP. Un fragment contenant le promoteur et le fragment EGFP a été amplifié avec succès en utilisant l’ADN génomique isolé des larves EGFP positives comme modèle. Cependant, le même fragment n’a pas été détecté lorsque l’ADN génomique a été isolé des larves de type sauvage comme modèle.
Les œufs pour la microinjection doivent être aussi frais que possible et doivent toujours être conservés sur de la glace avant la microinjection pour ralentir leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour répondre à des questions en génomique fonctionnelle des insectes nuisibles et développer des méthodes de contrôle génétique pour ce ravageur mondial.
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Aperçu
Cette étude décrit un protocole de transformation germinale réussie chez la légionnaire d'automne, Spodoptera frugiperda, en utilisant un système de transformation fondé sur piggyBac. La méthode promet une efficacité accrue de transformation chez les ravageurs lépidoptères et améliore la recherche en génomique fonctionnelle sur ces organismes.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Génie génétique chez les insectes ravageurs
- Techniques de biologie transformationnelle
- Applications de la génomique fonctionnelle
Contexte général
- La légionnaire est un ravageur agricole important.
- Le système de transposon piggyBac est connu pour son efficacité dans la livraison de gènes.
- L'amélioration de la transformation germinale est cruciale pour les stratégies de lutte contre les ravageurs.
Méthodes utilisées
- Microinjection d'œufs avec un plasmide piggyBac et de l'ARNm
- Spodoptera frugiperda comme modèle biologique
- Microscopie à fluorescence pour le criblage de larves transgéniques
Résultats principaux
- L'expression réussie de l'EGFP chez les larves transgéniques a montré la fonctionnalité du système piggyBac.
- L'expression de l'EGFP a été vérifiée par amplification de l'ADN génomique, permettant de distinguer les larves transgéniques des larves de type sauvage.
- La technique de transformation s'est révélée efficace pour produire des insectes ravageurs génétiquement modifiés.
Conclusions
- L'étude établit une méthode robuste de transformation germinale chez Spodoptera frugiperda.
- Les résultats contribuent à l'amélioration des mesures de contrôle génétique des ravageurs agricoles.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mise en place d'une transformation germinale efficace chez des ravageurs agricoles comme la légionnaire du maïs permet la génomique fonctionnelle pour la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les filières de lutte antiparasitaire. Ce protocole soutient la phase de découverte précoce en fournissant un système évolutif permettant d'explorer la fonction des gènes et d'évaluer les résultats phénotypiques dans un modèle d'insecte pertinent pour la maladie. Une transgénèse réussie facilite le criblage en aval et la découverte de biomarqueurs pour des stratégies de gestion génétique des ravageurs.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation fonctionnelle des gènes de ravageurs afin de valider des cibles pour des stratégies de contrôle génétique.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système reproductible pour générer des lignées transgéniques destinées à une évaluation cohérente des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en établissant un lien entre l'altération génique et les effets phénotypiques dans un modèle de ravageur.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des lignées rapporteuses fluorescentes pour le criblage à haut débit de perturbations génétiques.
- Valeur opérationnelle : Permet un génotypage standardisé par PCR et une PCR-TAIL pour la validation des sites d'insertion.
- Préparation aux tests : Produit des souches transgéniques stables adaptées au criblage de composés et aux tests phénotypiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la validation génique en phase de découverte à l'évaluation préclinique des mécanismes de contrôle génétique.
- Progression ajustée au risque : Permet d'évaluer l'essentialité des gènes et leur impact phénotypique avant toute application sur le terrain.
- Alignement sur les biomarqueurs : Facilite l'identification de marqueurs génétiques associés à des traits de sensibilité ou de résistance.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en permettant la validation de cibles par transgénèse, en soutenant l'identification de composés candidats par criblage phénotypique et en éclairant les décisions précliniques grâce à des modèles génétiques stables.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses en réalisant des invalidations génétiques ou des surexpressions de gènes chez la légionnaire d'automne afin d'évaluer la pertinence des cibles.
- Criblage : Génère des lignées transgéniques normalisées pour un criblage reproductible de modulateurs génétiques ou chimiques.
- Analytique : Fournit des lectures quantitatives par PCR et par fluorescence afin de mesurer l'intégration des transgènes et les niveaux d'expression.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte de fonctions géniques à l'évaluation préclinique d'approches de lutte génétique contre les ravageurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme de transgénèse réutilisable, applicable à l'ensemble des espèces de ravageurs lépidoptères, pour la validation de cibles à l'échelle du portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation de la cible grâce à une manipulation génétique directe dans un modèle de ravageur.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système de transgénèse évolutif et reproductible, associé à des protocoles standardisés d'injection microscopique et de criblage.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en réduisant l'incertitude biologique concernant l'essentialité de la cible.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur une validation phénotypique in vivo dans un modèle de ravageur.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en embryologie des insectes et en techniques de microinjection.
- Exige un microinjecteur automatisé, un microscope stéréo à fluorescence et du matériel de PCR pour la validation.
- Implique des protocoles normalisés pour la collecte des embryons, les conditions d'injection et le dépistage des lignées transgéniques au sein des équipes.
- Requiert l'adaptation des protocoles de température, d'humidité et d'alimentation à différentes espèces de lépidoptères.
- Dépend de la qualité et de la fraîcheur des embryons, l'efficacité de la microinjection étant influencée par le stade de développement.
