Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Ce protocole comble une lacune technique pour l’étude biochimique des C.elegans et élargit leur utilité en tant qu’organisme modèle. Cette technique est à la fois simple et robuste, permettant une isolation cohérente de l’extrait nucléaire de C.elegans fonctionnellement actif. Commencez par placer les animaux L1 synchronisés sur 10 plaques contenant des milieux de croissance de nématodes de 150 millimètres ensemencées avec Escherichia coli OP50, et laissez les animaux grandir pendant 48 heures à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.

Une fois les tampons hypotoniques et hypertoniques préparés, nettoyez l’homogénéisateur Balch en inondant la chambre de broyage avec de l’éthanol à 70%. Rincez ensuite la chambre avec de l’eau désionisée pour éliminer l’excès d’éthanol. Insérez la bille de carbure de tungstène dans la chambre de broyage.

Boucher les extrémités du canon de l’homogénéisateur Balch et fixer les bouchons avec les vis à molette fournies. Ensuite, préparez cinq millilitres des tampons hypotoniques et hypertoniques complets par échantillon, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, remplissez une seringue stérile de deux millilitres avec un millilitre de tampon hypotonique complet et rincez doucement la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch, en laissant environ 500 microlitres de tampon hypotonique complet dans la chambre.

Conservez l’homogénéisateur rincé sur de la glace et laissez-le refroidir pendant 30 minutes. Recueillir les animaux L4 bien nourris avec un tampon M9 dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger les animaux à 1 000 fois g pendant trois minutes. Retirez le surnageant et continuez à laver la pastille animale jusqu’à ce que le surnageant soit clair.

Ensuite, lavez les animaux avec trois millilitres de tampon hypotonique froid et centrifugez à nouveau comme démontré. Après avoir retiré le tampon hypotonique surnageant, ajoutez un millilitre de tampon hypotonique complet à la pastille animale et transférez la suspension animale dans une nouvelle seringue stérile de deux millilitres. Pour homogénéiser les animaux gardés sur la glace, poussez doucement les animaux à travers la chambre de broyage de l’homogénéisateur Balch chargé de la boule de tungstène.

Ensuite, récupérez les animaux dans la seringue et répétez cette procédure 30 fois. Après 30 cycles d’homogénéisation, prélever un maximum de suspension animale de l’homogénéisateur Balch et stocker la seringue avec la pointe positionnée vers le bas à l’intérieur d’un microtube de 1,7 millilitre. Retirez la bille de tungstène et nettoyez la chambre de broyage avec de l’eau désionisée.

Sécher et retourner la balle dans le tube étiqueté respectif. Insérez ensuite la bille de tungstène de 7,9880 millimètres de diamètre et de 12 micromètres de dégagement dans la chambre de broyage et refermez l’homogénéisateur. Rincez à nouveau la chambre de broyage avec un millilitre de tampon hypotonique complet glacé.

Broyer la suspension 25 fois comme démontré. Transférez la suspension animale dans un microtube propre de 1,7 millilitre et conservez la suspension sur de la glace. Abattez les corps et les débris des animaux par centrifugation.

Pipette 40 microlitres du surnageant à un tube étiqueté comme fraction d’entrée, et stocker la fraction sur de la glace. Transférer le surnageant restant dans un nouveau tube de 1,7 millilitre sans perturber la pastille, et centrifuger pour granuler les noyaux. Transférez ensuite le surnageant sans perturber les noyaux en granulés dans un nouveau tube de 1,7 millilitre marqué comme fraction cytosolique.

Pour laver la pastille de noyau, ajoutez 500 microlitres de tampon hypotonique complet à la pastille, suspendez la pastille et centrifugez à 4 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de la centrifugation, remettre en suspension la pastille nucléaire dans 500 microlitres de tampon hypotonique complet frais, puis centrifuger à nouveau l’échantillon comme démontré. Dissoudre ensuite la pastille dans 40 microlitres de tampon hypertonique complet.

Transférez la suspension nucléaire dans un nouveau tube de 1,7 millilitre étiqueté fraction nucléaire et stockez-la sur de la glace. Déterminez la concentration en protéines de trois fractions à l’aide d’un kit de quantification fluorescente. Aliquoter les fractions nucléaires dans des tubes à usage unique contenant six microgrammes de protéine nucléaire, et lyophiliser dans la glace sèche et le bain d’éthanol.

Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement. L’image de gel représentative montre les produits de transcription de l’extrait nucléaire des larves de Caenorhabditis elegans L4 à l’aide du modèle d’ADN promoteur du CMV. L’isolement réussi des protéines nucléaires actives a abouti à une bande de 132 paires de bases après une transcription in vitro, et un isolement infructueux a entraîné une bande faible ou l’absence d’une bande.

N’oubliez pas d’étiqueter clairement les tampons complets. Des tampons inappropriés peuvent nuire à la fonctionnalité des protéines nucléaires. De plus, gardez l’homogénéisateur glacé au froid pour éviter la dénaturation des protéines.

Le développement de cette technique a permis aux chercheurs de mesurer le taux de transcription de l’ARN de C.elegans dans des conditions stressantes, montrant que le taux de transcription de l’animal peut changer en fonction des conditions environnementales.