Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

Notre protocole présente un outil optimisé pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo et décrit l’intégration de techniques d’immobilisation ainsi que le pipeline d’acquisition et d’analyse de données pour l’imagerie cardiaque. Zebrafish est un système de modèle cardiaque avec un grand potentiel pour des applications comme le dépistage de médicaments. Les protocoles qui permettent une imagerie douce dans des conditions physiologiques sont cruciaux lors de l’étude des maladies cardiaques.

Le flux de travail présenté ici se concentre sur l’imagerie cardiaque embryonnaire du poisson zèbre, mais une version modifiée peut être appliquée à divers autres échantillons et expériences, notamment le calmar, le ver et l’hydre. Commencez par collecter les embryons obtenus à partir de la reproduction des lignées transgéniques souhaitées. Gardez les embryons à 28 degrés Celsius dans une boîte de Pétri remplie de milieu de poisson E3.

Utilisez une aiguille en verre d’alésage montée sur un micromanipulateur et reliée à un injecteur pico pour injecter 30 picogrammes d’ARNm alpha-bungarotoxine dans le jaune d’un ou deux embryons au stade cellulaire pour immobiliser le poisson. Conservez les œufs à 28 degrés Celsius dans une boîte de Pétri remplie de milieu E3 et transférez les œufs toutes les 24 heures dans un nouveau plat contenant du milieu E3 frais jusqu’à l’imagerie. Pour prévenir la formation de pigments, si le fond du poisson-zèbre n’est pas albinos, transférez le poisson 25 heures après la fécondation dans un nouveau plat contenant un milieu E3 contenant un inhibiteur de la tyrosinase de 0,2 millimole 1-phényl 2-thiourée, également connu sous le nom de PTU.

Pour redresser le tube en éthylène propylène fluoré, placez le tube dans un tube de sécurité autoclave en verre ou en acier avec le diamètre intérieur correct pour s’adapter aux tubes en polymère et à l’autoclave à 180 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois que les tubes atteignent la température ambiante, retirez le tube en polymère redressé. Pour nettoyer le tube, utilisez une seringue de 50 millimètres pour rincer le tube deux fois avec une molaire d’hydroxyde de sodium.

Couper le tube à la taille d’un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, placer dans un tube de centrifugeuse rempli de 0,5 molaire d’hydroxyde de sodium et ultrasons pendant 10 minutes. Rincer le tube d’éthylène propylène fluoré avec de l’eau distillée double, suivie d’éthanol à 70%. Tubes de transfert un tube de centrifugeuse frais contenait 70% d’éthanol et d’ultrasons pendant 10 minutes.

Après les ultrasons, rincez le tube pour la dernière fois avec de l’eau distillée double et stockez-le dans un tube de centrifugeuse contenant de l’eau double distillée. Après avoir dissous l’agarose à faible point de fusion dans un milieu E3, versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri en verre ou en plastique pour former une couche d’un à deux millimètres. Une fois l’agarose solidifiée, versez doucement le milieu E3 sur la gélose pour éviter le dessèchement.

Scellez la plaque avec un film de paraffine et conservez-la à quatre degrés Celsius. Décongeler la solution mère de tricaïne et ajouter 0,02% de tricaïne au milieu E3 sans bleu de méthyle à utiliser comme milieu d’incorporation. Utilisez une pipette en verre jetable pour transférer le poisson sur le support d’encastrement.

Vérifiez que le poisson a cessé de bouger et que le cœur bat à une vitesse similaire à celle du témoin. Coupez le tube en éthylène propylène fluoré à la longueur idéale avec une lame de rasoir. Préparez une seringue avec une canule d’extrémité émoussée.

Remplissez la seringue d’air, puis montez le tube sur l’aiguille et rincez doucement toute l’eau restante en vidant la seringue. Ensuite, remplissez le tube d’éthylène propylène fluoré monté sur une seringue avec un support. Insérez un embryon dans le tube, en gardant la tête du poisson près de l’extrémité du tube, en évitant la formation de bulles.

À l’aide d’une lame de rasoir, coupez soigneusement le tube au bord de la canule d’extrémité émoussée ou de l’aiguille. Après avoir jeté tout liquide sur le dessus du plat enduit d’agar, plongez le tube directement dans la gélose. Faites pivoter le tube et retirez-le pour libérer le bouchon du lit d’agarose.

Vérifiez la présence du bouchon de gélose à l’extrémité du tube. Pour l’imagerie à long terme, coupez trois à cinq trous dans le tube dans chaque direction cardinale, à au moins cinq millimètres au-dessus de l’extrémité du poisson en plaçant une lame de rasoir perpendiculaire à l’axe du tube et faites une incision dans le tube à 30 degrés jusqu’à atteindre le support de montage. Ensuite, faites une deuxième incision à 180 degrés pour créer un trou et roulez le tube pour visualiser clairement les coupes.

Transférer l’embryon monté dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un support d’intégration jusqu’à ce qu’il soit prêt à être photographié. Montez le tube dans le porte-échantillon et remplissez la chambre d’imagerie avec un support d’intégration. Placez le porte-échantillon sur la scène avec l’échantillon plongeant dans la chambre.

Vérifiez la santé des poissons incrustés en évaluant visuellement la fréquence cardiaque et, si le rythme cardiaque est trop lent, jetez l’échantillon. Utilisez toujours la même position d’échantillon pour l’imagerie reproductible et faites pivoter le poisson de sorte que les deux yeux soient dans le plan focal. Ensuite, faites pivoter le poisson d’environ 20 à 30 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 48 heures après l’imagerie de la fécondation.

Lorsque le poisson s’est adapté à la puissance du laser, sélectionnez le côté d’éclairage qui donne la meilleure qualité d’image. À chaque plan Z, enregistrez quatre à cinq battements de cœur à 300 images par seconde, ou plus. Pour enregistrer le cœur battant, déplacez l’échantillon par étapes à travers la feuille de lumière et utilisez un espacement Z d’un à deux micromètres pour couvrir toute la profondeur du cœur.

Chargez le fichier 4D dans un logiciel de rendu 3D pour explorer les données et générer des films du cœur de poisson zèbre rendu. À 48 heures après la fécondation, le cœur vient de subir une boucle et a deux chambres, le ventricule et l’oreillette, mais n’a pas encore développé les valves. Les différentes structures cardiaques telles que le ventricule, le canal auriculo-ventriculaire, l’oreillette, le tractus d’entrée et le tractus d’écoulement sont facilement reconnaissables.

Les données indiquaient des battements précis et révélaient des interactions complexes entre les deux couches cellulaires du cœur, le myocarde, une couche musculaire unicellulaire se contractant et générant de la force, et l’endocarde, une couche cellulaire unique reliant le cœur au système vasculaire. Le plus important est de toujours vérifier la santé de l’échantillon et un rythme cardiaque constant sous un stéréoscope. Alors que les techniques conventionnelles affectent souvent la forme ou la fonction du cœur, nos méthodes nous fournissent des données dynamiques et imperturbables du cœur battant qui nous aident à comprendre l’essentiel du cœur embryonnaire précoce.