Name: Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à feuille de lumière pour imager le cœur de Danio rerio in vivo avec immobilisation douce et conditions physiologiques préservées. Cette approche permet d'étudier la morphologie et la fonction cardiaques.

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Nous remercions Madelyn Neufeld pour l’illustration de la figure 2h. Ce travail a été soutenu par la Max Planck Society, le Morgridge Institute for Research, la Chan Zuckerberg Initiative et le Human Frontier Science Program (HFSP).

Tous les adultes et embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) ont été manipulés conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UW-Madison.
1. Préparation du poisson-zèbre
<ol><li>Manipuler le poisson-zèbre conformément aux protocoles établis25,26 et aux directives institutionnelles. Élever des poissons adultes de lignée transgénique désirée (voir Discussion). Recueillir les embryons et les conserver à 28 °C dans une boîte de Pétri remplie de milieu de poisson, par exemple E327.</li>
	<li>Choisissez une méthode d’immobilisation (voir Discussion).<ol>
<li>Si vous utilisez de l’ARNm α-bungarotoxine pour immobiliser le poisson, injecter 30 pg d’ARNm22 dans le jaune d’embryons à un ou deux stades cellulaires à l’aide d’une aiguille en verre alésée montée sur un micromanipulateur et reliée à un picoinjecteur28.</li>
		<li>Si vous utilisez de la tricaïne, faire tamponner la solution mère à 0,4 % à pH 7,0-7,4 avec une base tris de 1 M et conserver à -20 °C jusqu’à l’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservez les œufs dans une boîte de Petri remplie d’E3 à 28 °C et transférez-les toutes les 24 h dans une nouvelle boîte avec de l’E3 frais jusqu’à l’imagerie.</li>
	<li>Pour prévenir la formation de pigments, si le fond du poisson-zèbre n’est pas albinos, transférer le poisson 24 h après la fécondation (HPF) dans un nouveau plat E3 contenant 0,2 mM d’inhibiteur de la tyrosinase 1-phényl 2-thiourée (voir Discussion).</li>
</ol>2. Préparation des tubes FEP
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig01.jpg"> Figure 1: Nettoyage et redressement des tubes FEP. (a) Tubes FEP sur un tambour de câble. b) tubes FEP avant redressement. c) Tubes FEP en verre et en acier à tubes autoclaves sûrs. d) Rinçage des tubes FEP après redressement et refroidissement. e) Tube FEP coupé à la taille d’un tube de centrifugeuse pour la sonication. f) Rinçage des tubes FEP après sonication. g) Stockage des tubes FEP nettoyés et redressés dans un tube de centrifugeuse. h) Découpe du tube FEP avant l’imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Redresser les tubes FEP (Figure 1a,b) en les plaçant dans un tube en verre ou en acier sans danger pour autoclave (Figure 1c) avec le diamètre intérieur correct pour s’adapter aux tubes FEP, généralement 1,6 ou 2,4 mm, et autoclaver à 180 °C pendant 2 h. Laissez les tubes refroidir à température ambiante pendant au moins 5 h. Ensuite, retirez des tubes de redressement. REMARQUE: Utilisez des gants lorsque vous manipulez les tubes et travaillez avec des tubes de 50 cm à la fois.</li>
	<li>Nettoyez les tubes FEP. REMARQUE: Les seringues avec une pointe d’aiguille émoussée de la taille du tube FEP interne sont recommandées pour des raisons de sécurité, mais une aiguille ordinaire fonctionnera.<ol>
<li>Rincez deux fois les tubes avec 1 M de NaOH à l’aide d’une seringue de 50 mL (Figure 1d).</li>
		<li>Coupez les tubes FEP à la taille d’un tube de centrifugeuse de 50 mL avec une lame de rasoir (Figure 1e), placez les tubes coupés dans des tubes centrifugeux remplis de NaOH de 0,5 M et ultrasonez-les pendant 10 min.</li>
		<li>Rincer les tubes FEP avec du H2O double distillé, puis rincer à nouveau avec de l’éthanol à 70 % (Figure 1f).</li>
		<li>Transférer les tubes à 70% d’éthanol et d’ultrasons pendant 10 min.</li>
		<li>Rincez les tubes avec du H2O double distillé et stockez-les dans des tubes centrifuges dans du H2O double distillé (Figure 1g).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Préparation d’un plat d’agarose à 2%
<ol><li>Dans une fiole en verre, dissoudre la poudre d’agarose à point de fusion bas dans E3. Chauffer la solution au micro-ondes et la remuer toutes les 20 s, jusqu’à ce que toute la poudre soit dissoute.</li>
	<li>Versez l’agarose dans une boîte de Petri en verre ou en plastique pour obtenir une couche de 1 à 2 mm. Attendez que l’agarose soit solidifiée.</li>
	<li>Pour stocker, versez doucement E3 sur le dessus de la gélose pour éviter le séchage. Envelopper dans un film de paraffine et conserver à 4 °C.</li>
</ol>4. Préparation des supports d’intégration
<ol><li>Préparez suffisamment d’E3 pour remplir la chambre d’échantillonnage. REMARQUE: Évitez d’utiliser du bleu de méthyle si le support est en contact avec les lentilles d’objectif.</li>
	<li>Si vous utilisez de la tricaïne, décongelez la solution mère et ajoutez 0,02 % de tricaïne à e3.</li>
</ol>5. Montage de l’échantillon
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig02.jpg"> Figure 2: Montage de l’embryon dans un tube FEP. (a) Poissons anesthésiés sans pigment dans des milieux de montage. b) Une seringue munie d’une aiguille d’extrémité émoussée et d’un tube FEP attaché. c) Une fois que le milieu et le poisson sont absorbés dans le tube FEP, coupez le tube au bord de l’aiguille. d) Tremper le tube coupé dans un plat recouvert de 2 % d’agarose pour boucher son extrémité. e) Un poisson-zèbre dans un tube FEP bouché. f) Couper doucement le tube FEP à 30° pour créer des trous d’échange de gaz. g) Tube FEP avec quatre trous au-dessus d’un poisson-zèbre incrusté. h) Schéma d’un poisson-zèbre incrusté dans un tube FEP. Les trous et le bouchon de gélose sont indiqués. i) Plusieurs poissons-zèbres intégrés prêts pour l’imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>À l’aide d’une pipette en verre jetable, transférer le poisson sur un support d’encastrement (Figure 2a). Si vous utilisez de la tricaïne, transférer le poisson dans une boîte de Petri remplie d’E3 contenant de la tricaïne, 10 minutes avant l’imagerie. Dans les deux cas, visualisez sous un stéréomicroscope pour vérifier que le poisson a cessé de bouger et que le cœur bat à la même vitesse que le témoin.</li>
	<li>Coupez le tube FEP à la longueur idéale avec une lame de rasoir (Figure 1h). REMARQUE: La longueur doit être ajustée au porte-échantillon du microscope; la longueur typique est d’environ 3 cm.</li>
	<li>Préparez une seringue avec une canule d’extrémité émoussée. Remplissez la seringue d’air, puis montez le tube FEP sur l’aiguille et rincez doucement toute l’eau restante en vidant la seringue (Figure 2b). REMARQUE: Évitez de faire des bulles en débusquant lentement l’air.</li>
	<li>Avec le tube FEP monté sur seringue, prenez d’abord le média pour remplir le tube FEP, puis prenez une tête d’embryon vers le bas. Gardez la tête du poisson aussi près que possible de l’extrémité du tube. Évitez de faire des bulles; si une bulle est présente, jetez l’échantillon.</li>
	<li>À l’aide d’une lame de rasoir, coupez soigneusement le tube FEP au bord de la canule ou de l’aiguille à extrémité émoussée (Figure 2c).</li>
	<li>Jetez tout liquide sur le dessus du plat enduit d’agar. Plongez le tube FEP directement dans la gélose (Figure 2d). Faites pivoter le tube et retirez-le pour libérer le bouchon du lit d’agarose.</li>
	<li>Sous un stéréoscope, vérifiez la présence de la fiche de gélose à l’extrémité du tube (Figure 2e).</li>
	<li>Pour l’imagerie à long terme, coupez 3 à 5 trous dans le tube FEP dans chaque direction cardinale, à au moins 5 mm au-dessus de l’extrémité du poisson.<ol>
<li>Sous un stéréoscope, utilisez une lame de rasoir perpendiculaire à l’axe du tube pour faire une incision de 30° dans le tube FEP jusqu’à atteindre le support de montage (Figure 2f).</li>
		<li>Faites une deuxième coupe à 180° pour créer un trou (Figure 2g,h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer la tête d’embryon montée vers le bas dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec un support d’intégration jusqu’à ce qu’elle soit prête à être filmée (Figure 2i).</li>
</ol>6. Positionnement de l’échantillon
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig03.jpg"> Figure 3: Chambre d’échantillonnage. a) Tube FEP monté sur un porte-échantillon. b) La chambre d’échantillonnage avec les étapes et les objectifs. c) Vue de dessus de la chambre d’échantillonnage remplie de fluides, avec objectif d’éclairage et de détection dans une configuration T-SPIM. d) Porte-échantillon monté sur le microscope, avec l’échantillon dans la chambre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig04.jpg"> Figure 4: Positionnement de l’embryon pour l’imagerie cardiaque. (a) 24 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) poisson-zèbre avec les yeux mal alignés. a') Même poisson, avec les yeux alignés. (b) Même poisson tourné à -100° et (b') -50° pour une imagerie cardiaque optimale. c) 48 hpf de poisson zèbre dont les yeux sont mal alignés. c') Même poisson, avec les yeux alignés. d) Même poisson tourné de 30° pour une imagerie cardiaque optimale. Des flèches noires pointent vers le cœur. Barre d’échelle 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Au microscope, montez le tube FEP dans le porte-échantillon (Figure 3a) et remplissez la chambre d’imagerie avec un support d’incorporation (Figure 3b,c). Ensuite, placez le porte-échantillon sur la scène en plongeant l’échantillon dans la chambre (Figure 3d).</li>
	<li>Vérifiez l’état de santé de l’échantillon. Évaluez visuellement la fréquence cardiaque pour évaluer le bien-être général des poissons, car la fréquence cardiaque spécifique dépend du stade et de la température, en la comparant aux poissons témoins non montés. Si le rythme cardiaque est trop lent, jetez le poisson. REMARQUE: Assurer une manipulation douce des embryons, un transfert soigneux sur des supports d’intégration, l’imagerie immédiatement après l’incorporation, éviter les changements rapides de température, éviter la tricaïne et réduire le temps d’exposition à la tricaïne.</li>
	<li>Pour une imagerie reproductible, utilisez toujours la même position d’échantillon. Il est recommandé d’aligner les yeux et d’imager en angle.</li>
	<li>Faire pivoter le poisson de manière à ce que les deux yeux (Figure 4a,c) soient dans le plan focal (Figure 4a',c')</li>
	<li>À partir de cette position, faire pivoter le poisson d’environ 50 °-100 ° dans le sens des aiguilles d’une montre pour une imagerie de 24 hpf (Figure 4b, b'), et d’environ 20 ° à 30 ° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour une imagerie de 48 HPF (Figure 4d). REMARQUE: Le cœur précoce, avant 30 hpf, peut être difficile à imager en raison de sa position cachée (Figure 4b).</li>
</ol>7. Acquisition d’images
<ol><li>Choisissez le côté d’éclairage qui donne la meilleure qualité d’image et adaptez la puissance laser à chaque poisson. REMARQUE: Enregistrez la puissance laser utilisée pour l’analyse ultérieure de l’image.</li>
	<li>À chaque plan z, enregistrez 4 à 5 battements de cœur à 300 images par seconde (ips) ou plus. REMARQUE: Le champ de vision peut être recadré pour augmenter la vitesse d’acquisition. Par exemple, à 48 hpf, le cœur du poisson-zèbre bat deux à trois fois par seconde, par conséquent, à 300 ips, entre 300 et 600 images sont nécessaires pour acquérir quatre à six battements de cœur.</li>
	<li>Pour enregistrer le cœur battant, déplacez l’échantillon dans les deux sens à travers la feuille de lumière. Utilisez un espacement z de 1 à 2 μm, couvrant toute la profondeur du cœur.</li>
</ol>8. Traitement d’image
<ol><li>Synchronisez le film enregistré pour reconstruire un cœur 4D (x, y, z, temps) à l’aide d’un plugin Fidji (Image J229,30) comme décrit précédemment6.</li>
	<li>Pour explorer les données et générer des films du cœur de poisson zèbre rendu, chargez le fichier 4D (x, y, z, temps) dans un logiciel de rendu 3D.</li>
</ol>

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<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Lignes transgéniques pour imager le cœur
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig06.jpg"> Figure 6 : Comparaison des lignées transgéniques de poisson-zèbre marqueur cytoplasmique et membranaire. Vue antérieure-ventrale de cœurs de poisson zèbre de 48 hpf imagés avec LSFM. Les flèches blanches indiquent des structures visibles uniquement avec une ligne transgénique marqueur membranaire. a) Signal Tg(kdrl:EGFP)32 en cyan dans le cœur et (a') dans le ventricule. b) Signal Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 en rouge dans le cœur et (b') dans le ventricule. ( c,c') fusion des signaux Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) et Tg(kdrl:EGFP). Barre d’échelle 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’imagerie du cœur du poisson-zèbre nécessite un marquage précis des cellules cardiaques. Alors que l’épaisseur du myocarde est relativement constante dans toutes les cellules, les cellules endocardiques sont épaisses autour du noyau mais ont de minces protubérances membranaires, dans certaines régions plus minces que 2 μm. Les lignées transgéniques cytoplasmiques telles que Tg(kdrl:EGFP)32 marquent efficacement les régions autour des noyaux endocardiques, mais plus loin, le cytoplasme mince pourrait ne pas émettre suffisamment de photons pour être détecté avec des temps d’exposition aussi courts, ce qui entraînerait des trous artificiels dans les données (Figure 6a). En revanche, les lignées transgéniques marqueurs membranaires telles que Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 peuvent étiqueter efficacement l’endocarde et révéler plus de détails (Figure 6b,c). Pour chaque expérience, choisissez soigneusement la lignée transgénique la plus appropriée.
Immobilisation du poisson-zèbre Le choix de la technique d’immobilisation dépend de la durée de l’expérience et de l’âge du poisson à imager. La tricaïne a été couramment utilisée pour l’immobilisation du poisson-zèbre, principalement en raison de sa facilité d’utilisation. En effet, le simple fait d’ajouter 130 mg/L de tricaïne aux milieux piscicoles permet d’obtenir leur anesthésie en 10 min. Comme il peut entraîner des défauts de développement et affecter la physiologie cardiaque20,22, nous recommandons d’utiliser la tricaïne uniquement pour de courtes expériences (moins de 30 min). Pour une imagerie plus longue, les injections d’ARNm α-bungarotoxine au stade à une ou deux cellules paralysent les poissons jusqu’à 3 jours après la fécondation (dpf) sans affecter le développement cardiovasculaire ou la physiologie22.
Choisir les bons tubes FEP Les tubes FEP sont disponibles en différents diamètres et épaisseurs. Pour imager 0-5 dpf poisson, 0,8 mm est un bon diamètre intérieur; choisissez soit des tubes à paroi épaisse de 0,8 x 1,6 mm, soit des tubes à paroi mince de 0,8 x 1,2 mm. Nous recommandons les tubes à paroi mince; cependant, les parois plus épaisses offrent une stabilité et une rigidité accrues, ce qui peut être important si la chambre d’échantillonnage a un fluide fluide qui pourrait perturber et déplacer un tube mince. Pour les échantillons plus grands, 1,6 x 2,4 mm et 2 x 3 mm peuvent être utilisés.
Échanges de température et de gaz Un aspect essentiel du bien-être de l’embryon de poisson-zèbre est la température. Idéalement, maintenez le poisson à 28,5 °C pendant l’imagerie, car la température de l’environnement affecte le développement et la fréquence cardiaque34.
D’après notre expérience, l’échange d’oxygène à travers le bouchon d’agarose à 2% ne maintient qu’une fréquence cardiaque stable jusqu’à 3-4 dpf. Par conséquent, la coupe de trous dans le tube assure la diffusion de l’oxygène. Il peut également être nécessaire pour l’administration de médicaments à l’échantillon si vous le souhaitez.
Suspension du rythme cardiaque. Les vitesses d’acquisition rapides des microscopes à feuille de lumière équipés de manière appropriée permettent d’enregistrer le cœur battant in vivo. Cependant, pour acquérir une pile z non perturbée, on peut ralentir ou arrêter le cœur. Cependant, l’arrêt du cœur entraîne une relaxation du muscle cardiaque et peut entraîner l’effondrement du cœur6. La suspension du rythme cardiaque peut être effectuée en utilisant des morpholinos, des basses températures, un inhibiteur de la contraction musculaire ou de l’optogénétique. Ces méthodes ont chacune leurs inconvénients et doivent être soigneusement évaluées pour chaque expérience.
L’injection de 4 ng de morpholino cardiaque silencieux (sih) au stade d’une cellule peut arrêter le rythme cardiaque en ciblant le gène tnnt2a crucial pour la formation de sarcomères35. Les poissons-zèbres sih n’ont pas de battement de cœur et ne survivent que jusqu’à 7 dpf, lorsque les embryons commencent à dépendre du sang circulant pour l’oxygénation. Comme la morphogenèse cardiaque est entraînée par des forces génétiques et biomécaniques36, ces poissons présentent des malformations cardiaques autour de 3 dpf.
Comme le flux de Ca2+ est sensible à la température, la température influence la fréquence cardiaque chez les poissons-zèbres embryonnaires21. Par conséquent, l’abaissement de la température dans la chambre d’imagerie ralentit le rythme cardiaque. L’arrêt du rythme cardiaque nécessite des températures inférieures à 15 °C. Comme les poissons-zèbres sont généralement maintenus à 28,5 ° C, ces températures basses ne peuvent être maintenues que pendant de brèves périodes (moins de 10 min).
Des médicaments tels que les inhibiteurs chimiques des contractions musculaires, le 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), peuvent être ajoutés au milieu du poisson-zèbre (50 nM37,38) pour suspendre temporairement le rythme cardiaque. BDM est pratique à utiliser car il arrête la contraction cardiaque en moins de 15 minutes et peut être lavé pour restaurer la fonction cardiaque. Cependant, comme le BDM modifie le potentiel d’action cardiaque, il doit être utilisé avec prudence37.
Enfin, le cœur des poissons-zèbres transgéniques exprimant des canaux ioniques à faible luminosité ou des pompes telles que la channelrhodopsine ou l’halorhodopsine dans leur myocarde peut être manipulé et arrêté en éclairant le stimulateur cardiaque au niveau du tractus d’entrée avec de la lumière39,7,40,41,9.
Perspective Les outils et solutions optimisés présentés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo permettent une imagerie douce et à long terme de la dynamique cardiaque ultrarapide. L’intégration de l’échantillon peut être adaptée à différentes modalités d’imagerie, telles que la microscopie confocale, la microscopie à deux photons ou la tomographie par projection optique (OPT). La microscopie à feuille de lumière, cependant, est probablement la technique préférée qui offre une section optique à une vitesse suffisante pour capturer la dynamique du cœur. Bien que ce protocole se concentre sur l’imagerie cardiaque embryonnaire du poisson-zèbre, nous pensons qu’il pourrait également être appliqué à divers autres échantillons et expériences. Il sera intéressant de voir à l’avenir si des techniques d’intégration et d’imagerie similaires peuvent également être utilisées à des stades ultérieurs du développement, lorsque le cœur est plus caché et la larve moins translucide.

Pour découvrir les événements complexes et les interactions dans le cœur battant tôt, l’imagerie in vivo de l’ensemble de l’organe est nécessaire. Avec sa phototoxicité minimale1,2,3, son faible photoblanchiment4 et sa grande vitesse, la microscopie à feuille de lumière est devenue le principal outil d’imagerie pour le développement embryonnaire et cardiaque5,6. Il a fourni des informations sur la forme et la fonction cardiaques à une résolution spatiale et temporelle élevée7,8,9 et a permis aux chercheurs d’imager et de suivre à grande vitesse des parties du cœur marquées par fluorescence, d’étudier les forces hémodynamiques et de suivre le développement cardiaque directement à l’intérieur du corps des embryons en développement6,10,11,12.
Pour contraindre avec précision et de manière reproductible le poisson-zèbre dans le champ de vision, il existe une variété de protocoles d’intégration pour la feuille lumineuse, à court et à long terme, ainsi qu’un ou plusieurs échantillons13,14,15,16,17,18,19. Le protocole le plus courant implique l’immobilisation de la tricaïne et le montage de l’agarose à l’intérieur d’un tube en verre ou en plastique. Cependant, comme la fréquence cardiaque peut changer en raison de la température, des anesthésiques et du matériel d’intégration utilisé20,21,22, l’imagerie cardiaque du poisson-zèbre nécessite des protocoles spécifiques et doux pour assurer la santé de l’échantillon6,8,11,12,20,21,22,23 . Pour l’imagerie à court terme (jusqu’à une heure), on peut anesthésier le poisson dans 130 mg/L de tricaïne et l’incorporer dans des tubes en éthylène propylène fluoré (FEP) avec une solution d’agarose à 0,1% et un bouchon, comme décrit dans Weber et al. 201416. Cependant, comme la tricaïne peut entraîner des défauts de développement20,22, différents protocoles doivent être utilisés pour l’imagerie à long terme.
Nous décrivons ici une nouvelle stratégie pour l’imagerie cardiaque à long terme. Bien qu’il existe de nombreuses implémentations de feuilles lumineuses24, nous vous recommandons d’utiliser un échantillon suspendu dans un microscope T-SPIM (une lentille de détection et deux lentilles d’éclairage dans un plan horizontal avec l’échantillon suspendu verticalement dans la mise au point commune). Cela donne la liberté de mouvement et de rotation nécessaire pour le positionnement précis de l’échantillon. Les poissons sont immobilisés en injectant 30 pg α-bungarotoxine ARNm au stade à une ou deux cellules. α-bungarotoxine est un venin de serpent qui paralyse les muscles sans affecter le développement cardiovasculaire ou la physiologie22. Pour une imagerie précise et sans distorsion, nous recommandons de monter les poissons dans des tubes en FEP, un polymère avec un indice de réfraction presque identique à l’eau. Nous discutons de la meilleure façon de préparer les tubes FEP en les redressant et en les nettoyant avant l’imagerie. Les poissons sont ensuite montés dans ces tubes, tête en bas, dans un milieu, et le fond du tube est scellé avec un bouchon d’agarose à 2%, sur lequel reposent les têtes de poisson. La coupe de trous dans le tube FEP facilite les échanges gazeux et assure la croissance des poissons. Les poissons incorporés peuvent être conservés dans un support jusqu’à ce qu’ils soient montés sur un porte-échantillon juste avant l’imagerie. Nous suggérons également un pipeline d’acquisition et d’analyse de données pour une imagerie haute vitesse reproductible. En outre, nous discutons de l’utilisation de lignées transgéniques cytoplasmiques par rapport aux marqueurs membranaires pour le marquage robuste des cellules cardiaques, ainsi que de différentes options pour arrêter le cœur. Ces techniques de montage assurent la santé de l’échantillon tout en permettant de contraindre le cœur de manière précise et reproductible dans le champ de vision.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>22364111</td><td>Pour transporter des échantillons intégrés</td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td>Pour transporter des échantillons intégrés</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 ml Falcon</td><td></td><td>352070</td><td>Tubes de 50 ml pour l’étape de sonication et le stockage de tubes FEP nettoyés et redressés</td></tr><tr><td>Seringue de 50 ml de 309654 de 50</td><td></td><td></td><td>ml pour le nettoyage de la</td></tr> <tr><td>FEPAgarose, basse température de gélification</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td>Pour fabriquer</td></tr> des <tr><td>aiguilles à pointe émoussée, calibre 21</td><td>VWR</td><td>89500-304</td><td>Aiguille à extrémité arrondie pour tube FEP de 0,8 diamètre intérieur</td></tr><tr><td>Tube en verre borosilicaté</td><td>McMaster-Carr</td><td>8729K33</td><td>Tube pour redressement de tube FEP Diamètre extérieur de 9,5 mm, diamètre intérieur de 5,6, longueur de 30 cm, autres tailles disponibles</td></tr><tr><td>Tube en verre borosilicaté</td><td>McMaster-Carr</td><td>8729K31</td><td>Tube pour redressement de tube FEP Diamètre extérieur 6,35 mm, diamètre intérieur 4 mm, longueur 30 cm, autres tailles disponibles</td></tr><tr><td>Aiguilles conventionnelles, calibre 21</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Aiguille conventionnelle pour tube FEP de 0,8 diamètre intérieur</td></tr><tr><td>Pipette en verre jetable</td><td>Grainger</td><td>52NK56</td><td>Pour transférer des poissons, utiliser avec une pompe à pipette</td></tr><tr><td>E3 milieu pour embryons de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>poisson zèbreÉthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>Éthanol pour le nettoyage FEP</td></tr><tr><td>Tube FEP, 0,8 / 1,2 mm</td><td>ProLiquid</td><td>2001048</td><td>tube FEP à paroi mince, autres tailles disponibles</td></tr><tr>Tube FEP <td>Bola</td><td>S1815-04 0,8</td><td>/ 1,6 mm</td><td>avec paroi épaisse, autres tailles disponibles</td></tr><tr><td>Tube FEP</td><td>211581</td><td>BGB</td> Grand <td>tube FEP à paroi épaisse, autres tailles disponibles</td></tr><tr><td>Caoutchouc à main chaude Mitt</td><td>Cole-Parmer</td><td>691000</td><td>Pour transporter du matériel chaud après l’autoclave</td></tr><tr><td>Seringues Omnifix 1mL</td><td>B Braun</td><td>9161406V</td><td>Seringue de 1ml pour l’enrobage</td></tr><tr><td>d’une boîte de Pétri, petite</td><td>Dot Scientific</td><td>-94050</td><td>Pour faire des pompes à pipette à bouchon d’agarose</td></tr><tr><td></td><td>Argos Technologies</td><td>04395-05</td><td>Pour transférer du poisson, utiliser avec une pipette en verre jetable</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma Aldrich</td><td>103-85-5</td><td>Aussi connu sous le nom de : N-Phénylthiourée, 1-Phényl-2-thiourée, Phénylthiocarbamide</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Azpack</td><td>11904325</td><td>Pour couper les tubes FEP</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS24000</td><td>NaOH pour le nettoyage FEP</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Aussi connu comme : MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate, Tricaïne</td></tr></tbody></table>

microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

La recherche cardiaque embryonnaire a grandement bénéficié des progrès de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière in vivo rapide (LSFM). Combiné au développement externe rapide, à la génétique traitable et à la translucidité du poisson-zèbre, Danio rerio, le LSFM a fourni des informations sur la forme et la fonction cardiaques à haute résolution spatiale et temporelle sans phototoxicité ou photoblanchiment significatif. L’imagerie des cœurs battants remet en question les techniques existantes de préparation des échantillons et de microscopie. Il faut maintenir un échantillon sain dans un champ de vision restreint et acquérir des images ultrarapides pour résoudre le rythme cardiaque. Nous décrivons ici des outils et des solutions optimisés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo. Nous démontrons les applications de lignées transgéniques brillantes pour l’étiquetage des constituants cardiaques et présentons de nouvelles techniques d’intégration et d’immobilisation douces qui évitent les défauts de développement et les changements de fréquence cardiaque. Nous proposons également un pipeline d’acquisition et d’analyse de données adapté à l’imagerie cardiaque. L’ensemble du flux de travail présenté ici se concentre sur l’imagerie cardiaque embryonnaire du poisson-zèbre, mais peut également être appliqué à divers autres échantillons et expériences.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62741/62741fig05.jpg"> Figure 5 : Le cœur de poisson zèbre de 48 hpf. (a) Image fixe d’un z-frame, vue antérieure-ventrale de 48 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) poisson-zèbre, imagé avec LSFM, (b) reconstruction 3D de piles de films, vue coupée à travers l’atrium. c) Montage de quatre images sur un battement de cœur complet à un plan z. Les graphiques à secteurs indiquent l’heure pendant le battement de cœur. Barre d’échelle 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62741/62741fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Nous avons enregistré le cœur battant de 48 hpf du poisson-zèbre Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) selon le protocole détaillé ci-dessus (Figure 5). Une feuille de lumière laser de 488 nm et de 561 nm a éclairé l’échantillon simultanément. La fluorescence émise a été détectée perpendiculairement à l’aide d’un objectif de 16x/0,8 W et d’une caméra scientifique à semi-conducteurs à oxyde métallique (sCMOS).
À 48 hpf, le cœur vient de subir une boucle et possède deux chambres, le ventricule et l’oreillette mais n’a pas encore développé de valves. Dans nos films, les différentes structures cardiaques telles que le tractus d’entrée, le ventricule, le canal auriculo-ventriculaire (AVC), l’oreillette et la piste d’écoulement sont facilement reconnaissables (Figure 5a, b). Ces données montrent les battements précis et révèlent des interactions complexes entre les deux couches cellulaires du cœur : le myocarde, une couche musculaire unicellulaire se contractant et générant de la force (Figure 5c, rouge), et l’endocarde, une couche cellulaire unique qui relie le cœur au système vasculaire (Figure 5c, cyan).
La reconstruction du rythme cardiaque en x,y,z (3D) + temps (4D) + couleur (5D) a été réalisée selon Mickoleit et al.6. La reconstruction repose sur deux hypothèses : le mouvement du cœur est répétitif, et les données doivent être acquises avec un petit pas z. La sortie est un battement de cœur unique reconstruit en 5D, mesurant de 30 Go à 80 Go par battement de cœur. Pour restituer les données, nous avons utilisé l’outil open source gratuit FluoRender pour le rendu en profondeur31 car il a été conçu pour gérer des ensembles de données multidimensionnels et restituer facilement des films 5D de couches de cellules et de couches individuelles (Figure 5b).

Nous décrivons des outils optimisés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. Plus précisément, nous suggérons des lignées transgéniques cardiaques brillantes et présentons de nouvelles techniques d’intégration et d’immobilisation douces qui évitent les malformations développementales et cardiaques. Un éventuel pipeline d’acquisition et d’analyse de données adapté à l’imagerie cardiaque est également fourni.

Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

Notre protocole présente un outil optimisé pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo et décrit l’intégration de techniques d’immobilisation ainsi que le pipeline d’acquisition et d’analyse de données pour l’imagerie cardiaque. Zebrafish est un système de modèle cardiaque avec un grand potentiel pour des applications comme le dépistage de médicaments. Les protocoles qui permettent une imagerie douce dans des conditions physiologiques sont cruciaux lors de l’étude des maladies cardiaques.Le flux de travail présenté ici se concentre sur l’imagerie cardiaque embryonnaire du poisson zèbre, mais une version modifiée peut être appliquée à divers autres échantillons et expériences, notamment le calmar, le ver et l’hydre. Commencez par collecter les embryons obtenus à partir de la reproduction des lignées transgéniques souhaitées. Gardez les embryons à 28 degrés Celsius dans une boîte de Pétri remplie de milieu de poisson E3.Utilisez une aiguille en verre d’alésage montée sur un micromanipulateur et reliée à un injecteur pico pour injecter 30 picogrammes d’ARNm alpha-bungarotoxine dans le jaune d’un ou deux embryons au stade cellulaire pour immobiliser le poisson. Conservez les œufs à 28 degrés Celsius dans une boîte de Pétri remplie de milieu E3 et transférez les œufs toutes les 24 heures dans un nouveau plat contenant du milieu E3 frais jusqu’à l’imagerie. Pour prévenir la formation de pigments, si le fond du poisson-zèbre n’est pas albinos, transférez le poisson 25 heures après la fécondation dans un nouveau plat contenant un milieu E3 contenant un inhibiteur de la tyrosinase de 0,2 millimole 1-phényl 2-thiourée, également connu sous le nom de PTU.Pour redresser le tube en éthylène propylène fluoré, placez le tube dans un tube de sécurité autoclave en verre ou en acier avec le diamètre intérieur correct pour s’adapter aux tubes en polymère et à l’autoclave à 180 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois que les tubes atteignent la température ambiante, retirez le tube en polymère redressé. Pour nettoyer le tube, utilisez une seringue de 50 millimètres pour rincer le tube deux fois avec une molaire d’hydroxyde de sodium.Couper le tube à la taille d’un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, placer dans un tube de centrifugeuse rempli de 0,5 molaire d’hydroxyde de sodium et ultrasons pendant 10 minutes. Rincer le tube d’éthylène propylène fluoré avec de l’eau distillée double, suivie d’éthanol à 70%. Tubes de transfert un tube de centrifugeuse frais contenait 70% d’éthanol et d’ultrasons pendant 10 minutes.Après les ultrasons, rincez le tube pour la dernière fois avec de l’eau distillée double et stockez-le dans un tube de centrifugeuse contenant de l’eau double distillée. Après avoir dissous l’agarose à faible point de fusion dans un milieu E3, versez l’agarose fondue dans une boîte de Petri en verre ou en plastique pour former une couche d’un à deux millimètres. Une fois l’agarose solidifiée, versez doucement le milieu E3 sur la gélose pour éviter le dessèchement.Scellez la plaque avec un film de paraffine et conservez-la à quatre degrés Celsius. Décongeler la solution mère de tricaïne et ajouter 0,02% de tricaïne au milieu E3 sans bleu de méthyle à utiliser comme milieu d’incorporation. Utilisez une pipette en verre jetable pour transférer le poisson sur le support d’encastrement.Vérifiez que le poisson a cessé de bouger et que le cœur bat à une vitesse similaire à celle du témoin. Coupez le tube en éthylène propylène fluoré à la longueur idéale avec une lame de rasoir. Préparez une seringue avec une canule d’extrémité émoussée.Remplissez la seringue d’air, puis montez le tube sur l’aiguille et rincez doucement toute l’eau restante en vidant la seringue. Ensuite, remplissez le tube d’éthylène propylène fluoré monté sur une seringue avec un support. Insérez un embryon dans le tube, en gardant la tête du poisson près de l’extrémité du tube, en évitant la formation de bulles.À l’aide d’une lame de rasoir, coupez soigneusement le tube au bord de la canule d’extrémité émoussée ou de l’aiguille. Après avoir jeté tout liquide sur le dessus du plat enduit d’agar, plongez le tube directement dans la gélose. Faites pivoter le tube et retirez-le pour libérer le bouchon du lit d’agarose.Vérifiez la présence du bouchon de gélose à l’extrémité du tube. Pour l’imagerie à long terme, coupez trois à cinq trous dans le tube dans chaque direction cardinale, à au moins cinq millimètres au-dessus de l’extrémité du poisson en plaçant une lame de rasoir perpendiculaire à l’axe du tube et faites une incision dans le tube à 30 degrés jusqu’à atteindre le support de montage. Ensuite, faites une deuxième incision à 180 degrés pour créer un trou et roulez le tube pour visualiser clairement les coupes.Transférer l’embryon monté dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un support d’intégration jusqu’à ce qu’il soit prêt à être photographié. Montez le tube dans le porte-échantillon et remplissez la chambre d’imagerie avec un support d’intégration. Placez le porte-échantillon sur la scène avec l’échantillon plongeant dans la chambre.Vérifiez la santé des poissons incrustés en évaluant visuellement la fréquence cardiaque et, si le rythme cardiaque est trop lent, jetez l’échantillon. Utilisez toujours la même position d’échantillon pour l’imagerie reproductible et faites pivoter le poisson de sorte que les deux yeux soient dans le plan focal. Ensuite, faites pivoter le poisson d’environ 20 à 30 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 48 heures après l’imagerie de la fécondation.Lorsque le poisson s’est adapté à la puissance du laser, sélectionnez le côté d’éclairage qui donne la meilleure qualité d’image. À chaque plan Z, enregistrez quatre à cinq battements de cœur à 300 images par seconde, ou plus. Pour enregistrer le cœur battant, déplacez l’échantillon par étapes à travers la feuille de lumière et utilisez un espacement Z d’un à deux micromètres pour couvrir toute la profondeur du cœur.Chargez le fichier 4D dans un logiciel de rendu 3D pour explorer les données et générer des films du cœur de poisson zèbre rendu. À 48 heures après la fécondation, le cœur vient de subir une boucle et a deux chambres, le ventricule et l’oreillette, mais n’a pas encore développé les valves. Les différentes structures cardiaques telles que le ventricule, le canal auriculo-ventriculaire, l’oreillette, le tractus d’entrée et le tractus d’écoulement sont facilement reconnaissables.Les données indiquaient des battements précis et révélaient des interactions complexes entre les deux couches cellulaires du cœur, le myocarde, une couche musculaire unicellulaire se contractant et générant de la force, et l’endocarde, une couche cellulaire unique reliant le cœur au système vasculaire. Le plus important est de toujours vérifier la santé de l’échantillon et un rythme cardiaque constant sous un stéréoscope. Alors que les techniques conventionnelles affectent souvent la forme ou la fonction du cœur, nos méthodes nous fournissent des données dynamiques et imperturbables du cœur battant qui nous aident à comprendre l’essentiel du cœur embryonnaire précoce.

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JoVE Journal

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