Name: Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Apprenez à produire rapidement des lysats bactériens de haute qualité à partir d'une souche d'Escherichia coli autolysante. Cette méthode simple et économique rend l'expression génique sans cellule accessible à tous les chercheurs.

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Les auteurs remercient Zachary Sun et Richard Murray (California Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni le plasmide P_araBAD-gamS, et Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni une centrifugeuse de refroidissement à grande vitesse. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du programme ARO MURI et a été en partie soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japon.

1. Préparez les supports et les tampons.
<ol><li>Préparez 2xYTPG medium.<ol>
<li>Mélanger 62 g de poudre 2xYT, 5,99 g de phosphate de potassium monobasique, 13,93 g de phosphate de potassium dibasique et de l’eau désionisée à 2 L.</li>
		<li>Autoclave sur cycle liquide avec un temps d’exposition de 30 min14.</li>
		<li>À 400 mL de milieu 2xYTP du 1.1.2, ajouter 7,2 g de D-glucose (dextrose) et mélanger jusqu’à dissolution.</li>
		<li>Filtrer-stériliser à travers un filtre de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez la mémoire tampon S30A.<ol>
<li>Mélanger Tris-HCl (pH 7,7, concentration finale de 50 mM), glutamate de potassium (60 mM final) et glutamate de magnésium (14 mM final).</li>
		<li>Ajustez le pH à 7,7 à l’aide de 10 M KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez la solution 1 (voir le tableau 1).<ol>
<li>Remettre en suspension l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans 2 mL d’eau.</li>
		<li>Ajustez le pH à 8,0 à l’aide de KOH.</li>
		<li>Ajoutez tous les autres composants du tableau 1.</li>
		<li>Ajustez le pH à 7,6 à l’aide de 10 M KOH. Filtrer-stériliser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution de prémélange 2,5x (voir tableau 2).<ol>
<li>Mélanger tous les composants du tableau 2.</li>
		<li>Ajustez le pH à 7,5 à l’aide de KOH.</li>
		<li>Aliquote et congeler à -80 °C. REMARQUE : Une réaction de 20 μL utilise 8,9 μL de prémélange.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparez les cellules.
<ol><li>Strier les cellules autolysées sur des plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline à l’aide d’une boucle d’inoculation et croître à 37 °C (voir note 1).</li>
	<li>Choisissez une seule colonie dans une culture de démarrage de milieu LB / ampicilline à l’aide d’une pointe de pipette et cultivez à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Inoculer 400 mL de milieu 2xYTPG contenant 50 μg/mL d’ampicilline avec 400 μL de culture de démarrage, et croître à 37 °C dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 L, en agitant à 300 tr/min.</li>
	<li>Mesurer périodiquement la densité optique de la culture à 600 nm (OD600)à l’aide d’un spectrophotomètre pour lire une cuvette optique d’une longueur de trajet de 1 cm. Lorsque l’OD600 dépasse 1, commencez à diluer la culture 5 fois avant les mesures pour vous assurer que les mesures restent dans la plage linéaire d’un spectrophotomètre de laboratoire typique. Continuer à cultiver les cellules jusqu’à ce que la culture diluée 5 fois atteignel’OD 600 de 0,3 (correspondant à une culture OD600 de 1,5).</li>
</ol>3. Préparez le lysat.
<ol><li>Préparer le tampon S30A complété par 2 mM de dithiothréitol (TNT). Mélanger 3 mL de tampon S30A avec 6 μL de solution mère TNT à 1 M. Placer sur de la glace pour une utilisation à l’étape 3.7.</li>
	<li>Récolter les cellules par centrifugation à 1800 × g pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Jetez le surnageant en le versant et en utilisant une pipette pour éliminer tout liquide restant.</li>
	<li>Remettre la pastille dans 45 mL de tampon S30A froid (4-10 °C) à l’aide d’un mélangeur vortex.</li>
	<li>Peser un tube de centrifugeuse vide de 50 mL, y transférer les cellules et répéter les étapes 3.2-3.3 pour laver les cellules.</li>
	<li>Peser la pastille en soustrayant le poids d’un tube vide de 50 mL. Assurez-vous d’aspirer soigneusement tout surnageant restant pour assurer une mesure précise du poids des granulés. REMARQUE: Un rendement typique est d’environ 1,3 g de granulés cellulaires provenant de 400 mL de culture de production.</li>
	<li>Ajouter 2 volumes de tampon froid S30A complété par 2 mM de dithiothréitol, soit 2 mL de tampon pour 1 g de pastille cellulaire, et remettre les cellules en suspension vigoureuse par mélange vortex.</li>
	<li>Congelez les cellules. Placer le tube de 50 mL contenant les cellules dans un congélateur à -20 °C ou -80 °C jusqu’à ce que la pastille soit complètement congelée. REMARQUE: L’étape de congélation est un bon point d’arrêt pour la journée.</li>
	<li>Décongelez les cellules dans un bain-marie à température ambiante.</li>
	<li>Vortex vigoureusement pendant 2-3 min.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 45 min en agitant à 300 tr/min.</li>
	<li>Nettoyer l’échantillon de débris cellulaires lourds par centrifugation dans des tubes centrifuges transparents à 30 000 × g pendant 45 min à 4 °C. REMARQUE: Si une centrifugeuse capable de 30 000 x g n’est pas disponible, centrifugez pendant 45 min à 21 000 × get faites preuve d’une prudence supplémentaire à l’étape 3.13, car la pastille sera moins compacte.</li>
	<li>Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube avec une pipette, en évitant autant que possible de déranger la pastille. Si le surnageant transféré est contaminé par un matériau provenant de la pastille, répétez l’étape précédente.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL et centrifuger à nouveau à 21 000 × g (ou la vitesse maximale d’une centrifugeuse de table) pendant 5 min.</li>
	<li>Aliquotez l’autolysat nettoyé dans les volumes souhaités, en évitant soigneusement toute pastille restante, et congelez à -80 ° C ou utilisez-le immédiatement. REMARQUE : Une seule réaction de 20 μL utilise 8 μL d’autolysat.</li>
</ol>4. Expression génique sans cellules
REMARQUE: L’autolysat est maintenant prêt pour toute utilisation finale souhaitée. Ce qui suit est un exemple de protocole standard pour l’expression de gènes sans cellules.
<ol><li>Pour une réaction de 20 μL, mélanger sur glace 8 μL d’autolysat et 8,9 μL de prémélange. Voir NOTE à la fin de la section du protocole concernant l’optimisation des concentrations de glutamate de magnésium et de PEG 8000.</li>
	<li>Ajouter de l’ADN (p. ex., pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 à une concentration finale de 8 nM), tout autre réactif et de l’eau à 20 μL.</li>
	<li>Placez la réaction dans une microplaque de 384 puits et mesurez le temps de fluorescence et/ou les extrémités à l’aide d’un lecteur de plaques. Pour la protéine fluorescente verte (GFP), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.</li>
</ol>5. Modifications du protocole
REMARQUE : Les modifications suivantes du protocole lui permettent de servir d’autres applications.
<ol><li>Expression génique sans cellules à l’aide de modèles d’ADN linéaires<ol>
<li>Effectuez les étapes de la section 4, en complétant la réaction avec une protéine GamS purifiée de 2,2 μM (exprimée et purifiée comme décrit12)avant l’ajout de l’ADN linéaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expression génique sans cellule incorporant la dégradation des protéines<ol>
<li>À l’étape 2.1, utilisez des cellules autolysées contenant le plasmide pACYC-FLAG-dN6-His (voir la Table des matériaux). Dans tous les milieux de croissance, inclure en outre 34 μg/mL de chloramphénicol.</li>
		<li>À l’étape 2.3, inclure 40 μM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans le milieu de croissance pour induire l’expression du plasmide.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.2 à 3.4 (lavage) deux fois de plus (pour un total de trois lavages) pour assurer l’élimination complète du chloramphénicol, qui est un inhibiteur de la traduction. Pour les deux premiers lavages (étape 3.4), remplacer le tampon S30A par une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4).</li>
		<li>À l’étape 4.2, compléter avec un supplément de 3 mM d’ATP (ajouté à partir d’une solution mère de 100 mM d’ATP dans l’eau, pH 7,2) et de 4,5 mM de glutamate de magnésium (en utilisant une solution mère de 1 M dans l’eau) (concentrations finales) pour compenser l’utilisation élevée d’ATP par ClpXP, ainsi que la chélation du magnésium par l’ATP supplémentaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expression génique sans cellules à l’aide de lectures basées sur LacZ (y compris colorimétriques)<ol>
<li>À l’étape 2.1, utilisez des cellules de type automatique qui n’expriment pas nativement LacZ (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativement, préparez le lysat directement à partir de cellules lyophilisées.<ol>
<li>Effectuez toutes les étapes de 1.1 à 3.7.</li>
		<li>Mélanger 8 μL de suspension cellulaire avec 8,9 μL de prémélange.</li>
		<li>Ajoutez de l’ADN plasmidique (si vous le souhaitez), d’autres réactifs personnalisés et de l’eau pour atteindre un volume final de 20 μL.</li>
		<li>Transférer la réaction sur une microplaque de 384 puits et la lyophiliser. REMARQUE: Les échantillons lyophilisés peuvent être conservés jusqu’à une semaine et peut-être plus longtemps.</li>
		<li>Pour commencer la réaction, réhydratez-la avec 18 μL d’eau désionisée complétée par l’ADN ou d’autres réactifs souhaités.</li>
		<li>Suivez la dynamique de fluorescence dans un lecteur de plaques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>NOTE 1: Les cellules autolysées sont conçues pour se lyser lors d’un cycle de gel-dégel, il est donc particulièrement important d’utiliser un cryoprotecteur lors de la fabrication de stocks congelés. Nous avons congelé les stocks dans 24 % de glycérol en poids/vol et les avons stockés à -80 °C.
NOTE 2: Les ions magnésium et PEG 8000 sont essentiels pour la performance du lysat. Le prémélange de base 2,5x, basé sur des données publiées précédemment, contient 6 mM de glutamate de magnésium et 4,8% p/vol de PEG 8000, qui deviennent respectivement 2,4 mM et 1,9% dans la réaction finale. L’autolysat préparé avec le protocole ici fonctionne généralement mieux avec 5 mM de Mg-glutamate supplémentaires et 1,5% de PEG 8000 dans la réaction finale. Cependant, cela peut être optimisé dans la gamme d’un 0-10 mM Mg glutamate supplémentaire et d’un PEG 8000 supplémentaire de 0-3% (par rapport au prémélange de base). Pour préparer le prémélange avec les 5 mM de Mg-glutamate supplémentaires recommandés et 1,5 % de PEG 8000 (concentrations finales), mélanger 380 μL de prémélange avec 4,75 μL de glutamate de magnésium à 1 M et 36,1 μL de PEG 8000 à 40 % poids/volume.

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<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
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</ol>

J.H. est cofondateur de GenCirq Inc., qui se concentre sur les thérapies contre le cancer. Il siège au conseil d’administration et détient des participations dans GenCirq.

Le protocole décrit ici produit un lysat bactérien hautement actif pour l’expression de gènes sans cellules. La clé est d’utiliser des cellules porteuses du plasmide pAD-LyseR, qui exprime l’endolysine du phage lambda de manière cytosolique. Ces cellules sont potentialisées pour se lyser lors de la perméabilisation de la membrane interne, permettant à l’endolysine d’accéder à la paroi cellulaire, ce que la méthode réalise grâce à un simple cycle de gel-dégel. Parce que les cellules se lysent efficacement, le produit est ...

L’expression génique dans les lysats sans cellules présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de cellules vivantes1,2,3,4. Les lysats peuvent être facilement modifiés biochimiquement et utilisés dans des conditions qui pourraient être préjudiciables ou impossibles à atteindre dans les cellules vivantes. Les circuits d’expression génique n’ont pas à rivaliser ou à rivaliser avec les processus biologiques de l’hôte, et tester de nouveaux circuits génétiques est aussi simple que d’ajouter de l’ADN. Pour ces raisons, l’expression génique sans cellules a trouvé diverses applications, des biocapteurs5,6 au prototypage rapide de circuits de gènes synthétiques7,8 au développement de cellules artificielles9. La plupart des expressions géniques sans cellules utilisent des lysats cellulaires qui ont été hautement transformés, nécessitant généralement des protocoles longs et complexes, un équipement spécialisé et / ou des étapes sensibles pouvant entraîner des variations significatives entre les utilisateurs et les lots10,11.
Cet article décrit une méthode simple et efficace de production de lysat sans cellule qui nécessite un traitement et une expertise minimes (Figure 1A)12. La méthode repose sur des cellules d’E. coli qui sont conçues pour lyser après un simple cycle de gel-dégel. Les cellules expriment une endolysine du phage lambda qui dégrade la paroi cellulaire. Au fur et à mesure que les cellules se développent, cette endolysine reste dans le cytoplasme, séquestrée de la paroi cellulaire. Cependant, un simple cycle de gel-dégel perturbe la membrane cytoplasmique, libérant l’endolysine dans le périplasme, où elle dégrade la paroi cellulaire, entraînant une lyse cellulaire rapide. Le protocole peut être complété avec seulement quelques heures de travail pratique et ne nécessite qu’un congélateur, une centrifugeuse capable de 30 000 × g (pour des résultats optimaux; des vitesses plus faibles peuvent être utilisées avec plus de soin pour ne pas déranger le granulé), un mélangeur vortex et une solution tampon simple. Le lysat fonctionnel peut même être produit en lyophilisant les cellules et en les réhydratant in situ. Cependant, cette méthode produit des lysats avec une activité plus faible, probablement en raison des débris cellulaires restants.
Les lysats sont très actifs pour l’expression de gènes sans cellules, et ils peuvent être améliorés de différentes manières en fonction de l’utilisation finale. Le taux de synthèse des protéines peut être encore augmenté en concentrant le lysat à l’aide de concentrateurs de spin standard. L’ADN linéaire peut être protégé de la dégradation en ajoutant de la protéine GamS purifiée. La dégradation des protéines, nécessaire à une dynamique de circuit plus complexe telle que l’oscillation, peut être obtenue en co-exprimant un hexamère ClpX dans la souche13productrice d’autolysats. Enfin, les lectures visuelles basées sur LacZ sont activées en utilisant une souche autolysée dépourvue de lacZ. Dans l’ensemble, cette méthode produit un lysat sans cellules hautement actif qui convient à un large éventail d’applications.

<table><tbody><tr><td>2xYT média</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>ou</td></tr><tr><td>équivalent Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15, coupure 3 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>en option, peut être utilisé pour concentrer le lysat, sélectionner la capacité du concentrateur appropriée pour le volume à concentrer</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>ou carbénicline, une variante plus stable</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>D-glucose (dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>dithiothréitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) porteur de pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) et Delta ; lacZ porteur de pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>ou</td></tr><tr><td>équivalent LB média Fisher</td><td>Scientific</td><td>DF0446075</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>glutamate</td> <td>de magnésiumSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>ou</td></tr><tr><td>équivalent glutamate de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>ou</td></tr><tr><td>hydroxyde de potassium équivalent (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>pour ajuster le pH</td></tr><tr><td>phosphate de potassium dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>mélange d’ARNt</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td></td><td>UTP United States Biosciences</td><td>23160</td><td>ou équivalent</td></tr></tbody></table>

production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

L’expression génique sans cellules offre le pouvoir de la biologie sans les complications d’un organisme vivant. Bien qu’il existe de nombreux systèmes d’expression génique de ce type, la plupart sont assez coûteux à l’achat et / ou nécessitent un équipement spécial et une expertise finement affinée pour produire efficacement. Ce protocole décrit une méthode de production de lysat sans cellules bactériennes qui soutient des niveaux élevés d’expression génique, en utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire standard et nécessitant un traitement minimal. La méthode utilise une souche d’Escherichia coli produisant une endolysine qui n’affecte pas la croissance, mais qui lyse efficacement une pastille cellulaire récoltée après un simple cycle de gel-dégel. Le seul traitement supplémentaire requis est une brève incubation suivie d’une centrifugation pour éliminer l’autolysat des débris cellulaires. Des circuits géniques dynamiques peuvent être obtenus grâce à l’expression hétérologue de la protéase ClpX dans les cellules avant le prélèvement. Une souche d’E. coli dépourvue du gène lacZ peut être utilisée pour des applications de biodétection haute sensibilité et sans cellules à l’aide d’une lecture colorimétrique ou fluorescente. L’ensemble du protocole nécessite aussi peu que 8-9 heures, avec seulement 1-2 heures de travail pratique de l’inoculation à l’achèvement. En réduisant le coût et le temps d’obtention du lysat sans cellule, cette méthode devrait augmenter l’abordabilité de l’expression génique sans cellule pour diverses applications.

Des résultats représentatifs peuvent être observés en utilisant l’autolysat pour exprimer la GFP à partir d’un plasmide exprimant de manière constitutive, ici pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, et en enregistrant un cours temporel de fluorescence GFP dans un lecteur de plaques(Figure 1B). Une série de dilution d’ADN plasmidique a trouvé une forte expression même à 1 nM d’ADN. Par rapport à un lysat disponible dans le commerce, l’autolysat peut produire un rendement total plus élevé et atteind...

Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.

Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

En utilisant ce protocole, des lysats de cellules bactériennes de haute qualité peuvent être produits en utilisant uniquement des équipements de laboratoire courants largement disponibles, ce qui rend l’expression génique sans cellules facilement accessible à la plupart des chercheurs. La combinaison de l’autolyse cellulaire programmée avec un cycle lyophilisation-décongélation ou lyophilisation permet de créer une approche pratique, laborieuse et rentable pour la production rapide de lysats bactériens pour l’expression génique sans cellule. Commencez par utiliser une boucle d’inoculation pour strier les cellules d’une souche d’E. coli d’autolyse sur des plaques de gélose LB contenant 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, à l’aide d’une pointe de pipette, choisissez une seule colonie dans la plaque de gélose et ajoutez-la dans un tube de culture contenant un milieu LB avec de l’ampicilline. Cultivez cette culture de démarrage à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 400 microlitres de la culture de démarrage dans une fiole d’Erlenmeyer d’un litre contenant 400 millilitres de milieu 2xYTPG complété par 50 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 300 tr / min. À l’aide d’un spectrophotomètre et d’une cuvette optique d’une longueur de trajet d’un centimètre, mesurez périodiquement la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Lorsque la densité optique dépasse un, commencez à diluer la culture cinq fois avant les mesures pour vous assurer que les mesures restent dans la plage linéaire d’un spectrophotomètre de laboratoire typique.Une fois que la densité optique de la culture quintuple diluée atteint 0,3, retirez la fiole de l’incubateur et procédez à la préparation du lysat. Pour préparer le lysat, prélèvez les cellules par centrifugation à 1 800 x g pendant 15 minutes à température ambiante. Versez le surnageant et retirez le liquide restant à l’aide d’une pipette.Ajouter 45 millilitres de tampon S30A froid à la pastille et remettre la pastille en suspension par vortex. Ensuite, pesez un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres avant de transférer les cellules dans le tube. Centrifugez à nouveau les cellules et jetez le surnageant.Aspirer tout surnageant restant à l’aide d’une pipette. Pesez à nouveau le tube et soustrayez le poids du tube vide du poids affiché pour obtenir le poids de la pastille. Pour chaque milligramme de pastille cellulaire, ajoutez deux microlitres de tampon S30A froid complété par deux millimolaires de dithiothréitol.Ensuite, ressuspendez les cellules par un vortex vigoureux. Ensuite, congelez les cellules en les plaçant dans un congélateur négatif de 20 ou 80 degrés Celsius jusqu’à ce que la pastille soit complètement congelée, puis décongelez les cellules dans un bain-marie à température ambiante et un vortex vigoureusement pendant deux à trois minutes. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes en agitant à 300 tr / min, puis nettoyer l’échantillon de débris cellulaires lourds en centrifugant dans des tubes centrifuges transparents à 30 000 x g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.Transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Si le surnageant transféré est contaminé par un matériau provenant de la pastille, répétez la centrifugation. Transférer le surnageant dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre.Et centrifugez une fois de plus à 21 000 x g ou la vitesse maximale d’une centrifugeuse de table pendant cinq minutes. Aliquotez l’autolysat dégagé dans les volumes souhaités et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour l’expression génique sans cellules à l’aide de l’autolysat, mélanger huit microlitres d’autolysat et 8,9 microlitres de prémélange sur glace.Ajouter de l’ADN à une concentration finale de huit nanomoles, tout autre réactif nécessaire et de l’eau pour obtenir un volume final de 20 microlitres. Ajoutez la réaction à une microplaque de 384 puits et utilisez un lecteur de plaque pour mesurer le cours du temps de fluorescence et les extrémités. L’expression de GFP à l’aide de l’autolysat avec une série de dilution d’ADN plasmatique donne une expression forte même avec un ADN nanomolaire.En comparant l’expression de GFP entre un lysat disponible dans le commerce et l’autolysat, l’autolysat a produit des niveaux comparables de GFP. La variabilité entre les lots de lysat produits dans deux laboratoires différents par des chercheurs différents était d’environ deux fois. Les trois variables les plus critiques sont le rapport granulé cellulaire/tampon, le transfert d’un surnageant sans débris et l’utilisation d’une concentration optimale de PEG et de magnésium dans la réaction finale.Une fois l’extrait préparé, un large arsenal de protocoles existants développés pour les systèmes d’expression sans cellules E. coli peut être utilisé, tels que la dégradation médiée par ClpXP ou la détection du quorum médiée par AHL.

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Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

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