Optimisation de la configuration et des conditions de l’électrorétinogramme ex vivo pour étudier la fonction de la rétine dans les petits et grands yeux

Ce protocole démontre les conditions nécessaires au maintien de la fonction rétinienne dans l’ERG ex vivo, en particulier l’onde B extrêmement sensible produite par les cellules ON-bipolaires. Avec l’ERG ex vivo, nous pouvons mesurer la fonction de différents types de neurones rétiniens avec un rapport signal sur bruit élevé tout en permettant l’introduction facile d’agents pharmacologiques. Cette méthode se prête particulièrement bien à quantifier l’efficacité des agents pharmacologiques sur la fonction rétinienne et la maladie.

Pour commencer, convertissez une configuration de réseau multi-électrodes en connectant le porte-échantillon ERG ex vivo à un amplificateur différentiel via une platine de tête. L’amplificateur doit être branché sur l’entrée analogique de la carte d’interface du système multi-électrodes. Utilisez le logiciel d’enregistrement du réseau multi-électrodes pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo.

Réglez le gain de l’amplificateur différentiel sur 100 et ajoutez une amplification de tension supplémentaire de 10X, en fonction des spécifications du numériseur. Réglez le filtre passe-bas sur 100 hertz. Alternativement, pour convertir une configuration de pince de patch, connectez le porte-échantillon ERG ex vivo via un cheval-bas à un amplificateur différentiel, qui doit être connecté à la tête de l’amplificateur de pince de patch.

Utilisez le logiciel du système de pince patch et le numériseur pour enregistrer et stocker les données d’entrée de l’ERG ex vivo. Définissez les paramètres comme indiqué précédemment. Connectez des LED avec les longueurs d’onde appropriées au microscope.

Pour contrôler les stimuli lumineux, utilisez un pilote LED contrôlé par des sorties analogiques d’un numériseur. Contrôlez les LED avec un logiciel d’enregistrement qui permettra le déclenchement de stimuli lumineux. Ensuite, calibrez le flux lumineux des LED à la position de la rétine dans le porte-échantillon à l’aide d’une photodiode.

Si nécessaire, insérez des filtres de densité neutre pour atténuer l’intensité lumineuse dans le trajet de la lumière. Pour préparer l’électrode, insérez une électrode de pastille de chlorure d’argent dans un connecteur de leurre fileté. Remplissez l’intérieur du connecteur de leurre avec de la colle chaude et insérez une douille de deux millimètres dans la colle chaude du côté non fileté.

Souder un fil d’argent de l’électrode EP-1 à la prise de deux millimètres. Vissez l’électrode finie avec un joint torique sur le filetage dans les orifices d’électrode du porte-échantillon ERG ex vivo. Pour les grands yeux, y compris les yeux de donneurs humains, nettoyez le globe du tissu conjonctif restant et retirez le segment antérieur et le cristallin.

Utilisez un scalpel pour faire une coupe à environ trois millimètres du limbe. Insérez des ciseaux de dissection incurvés dans l’incision et coupez le long du limbe pour enlever la partie antérieure de l’œil avec le cristallin. Obtenir des échantillons rétiniens pour l’électrorétinographie ex vivo avec un poinçon de biopsie jetable de trois à six millimètres.

Pour monter le tissu sur le porte-échantillon, placez la moitié inférieure du porte-échantillon dans une grande boîte de Petri et remplissez-la de milieu d’Ames oxygéné de sorte que le dôme du porte-échantillon soit juste submergé. Saisissez soigneusement le bord de la rétine avec une pince fine et transférez la rétine sur le dôme du porte-échantillon ex vivo, côté photorécepteur tourné vers le haut. Soulevez le porte-échantillon de la solution d’Ames en veillant à ce que la rétine reste en place.

Séchez complètement la plaque du porte-échantillon pour minimiser le bruit, la diaphonie électrique et le shunt de signal. Ensuite, assemblez les deux moitiés du porte-échantillon avec quatre vis et connectez la ligne de perfusion. Entraînez l’électrode dans la moitié inférieure du porte-échantillon et connectez le câble anodique au côté interne de la rétine et le câble cathodique au côté photorécepteur.

Perfuser le porte-échantillon avec au moins un millilitre par minute de milieu d’Ames oxygéné pendant 10 à 20 minutes pour permettre aux réponses lumineuses de se stabiliser. L’ERG ex vivo a permis l’enregistrement des réponses lumineuses du photorécepteur et des cellules on-bipolaires de la rétine de la souris. L’enregistrement des réponses des photorécepteurs des rétines de donneurs humains a été possible avec un délai d’énucléation post-mortem allant jusqu’à cinq heures et un délai de moins de 20 minutes pour les réponses des cellules ON-bipolaires.

Dans des conditions idéales, les amplitudes de réponse et la cinétique dans les deux types de cellules étaient relativement stables au fil du temps, mais ont montré un lent déclin 40 à 45 minutes après le montage de la rétine sur le porte-échantillon. La température réduite dans le porte-échantillon a considérablement ralenti la cinétique des photorécepteurs et des cellules ON-bipolaires. Cependant, il a diminué l’amplitude de l’onde B mais pas l’onde A.

Inversement, le ralentissement du taux de perfusion a réduit les amplitudes des réponses du photorécepteur et des cellules ON-bipolaires, mais n’a pas affecté le temps implicite de l’onde A ou B. L’arrêt de la perfusion pendant 10 minutes suivi d’une reperfusion a entraîné une perte complète de la fonction des cellules ON-bipolaires avec des réponses photorécepteurs préservées. Une vitesse de perfusion et une température physiologique suffisantes sont essentielles pour obtenir des réponses stables, en particulier des cellules ON-bipolaires dans l’ERG ex vivo.

Ce protocole permet d’explorer en profondeur les différences de fonction des photorécepteurs dans la maculaire et la périphérie humaines, répondant à des questions qui ne pouvaient auparavant être posées que chez les primates non humains.