Un test d’alimentation à microplaques à haut débit pour la quantification de la consommation chez la drosophile

Le test d’alimentation par microplaques fournit une méthode simple, économique et à haut débit pour mesurer le comportement alimentaire de la drosophile, et offre de multiples avantages par rapport à d’autres méthodes plus élaborées. La quantification de la consommation en mesurant l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques élimine les mesures manuelles et évite la saisie manuelle des données. Les données se prêtent également à l’extraction et au traitement programmatiques.

Avec ce test à haut débit, nous pouvons quantifier la consommation de nutriments solubles dans l’eau, de médicaments, de produits pharmaceutiques ou de toxines, et le système peut être modifié pour des applications à une variété d’espèces d’insectes. Commencez par verser l’agarose fondue dans un bac à réactif et distribuez 80 microlitres d’agarose fondue dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal. Réfrigérer les restes d’agarose jusqu’à une semaine dans un sac scellé et les refermer pour en faire des assiettes supplémentaires.

Si les bandes de barrière sont trop lâches, enroulez-les autour du doigt pour leur donner une courbure pour les maintenir dans les canaux. Insérez les bandes de barrière dans les canaux de bande de barrière pour préparer les coupleurs. Apposez l’attelage sur une plaque de famine, en veillant à ne pas utiliser l’attelage pour manipuler la plaque car l’attelage pourrait glisser.

Assurez-vous que le coin incliné de l’attelage correspond au coin incliné de la microplaque pour maintenir une orientation correcte. Sous anesthésie au CO2, triez les mouches de trois à cinq jours. Chargez les mouches individuelles par colonne dans la plaque de famine.

Fermez chaque colonne au fur et à mesure qu’elle se remplit en ajustant sa bande de barrière à la position fermée. Enregistrez soigneusement la disposition de l’échantillon dans la microplaque. Une fois la plaque de famine remplie, laissez les mouches récupérer spontanément après avoir retiré le CO2 et affamez-les pendant six heures à partir de leur temps d’anesthésie initial.

Préparer 10 millilitres d’aliments liquides dans un tube conique de 15 millilitres en dissolvant 0,4 gramme de saccharose et 0,1 gramme d’extrait de levure dans 10 millilitres d’eau distillée. Vortex le tube jusqu’à ce que les solides se dissolvent complètement. Ajouter 40 microlitres de solution de colorant et transférer la nourriture liquide dans une seringue de 10 millilitres avec un filtre de 0,45 micromètre.

Filtrer environ 1,5 millilitre de la solution à la fois dans un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre. Mettez la seringue contenant la solution de côté et filtrez la solution supplémentaire au besoin pendant la préparation de la plaque d’alimentation. Préparez une plaque d’alimentation en scellant le fond d’une microplaque de 1536 puits avec un film d’étanchéité.

Utilisez une palette d’étanchéité pour bien adhérer au film. Ensuite, coupez l’excès de film sur les bords gauche et droit avec une lame de rasoir. Distribuer 10 microlitres de la colonne d’aliments liquides filtrés dans le puits supérieur gauche pour chaque groupe de quatre puits de la microplaque de 1536 puits.

Une fois tous les puits remplis, appliquez un film d’étanchéité sur le dessus de la plaque, en suivant les mêmes étapes que celles utilisées pour sceller le fond de la microplaque. Répétez l’opération pour le nombre de plaques souhaité. Centrifugez les plaques à 200 fois G pendant 10 secondes pour déposer le fluide.

Ne laissez pas la plaque refroidir, car cela pourrait provoquer une accumulation de condensation dans les puits, obscurcissant les lectures d’absorbance. Perforez les puits sur la surface supérieure de la plaque avec l’outil de sonde à aiguille équipé d’une aiguille de 0,25 millimètre de diamètre, en utilisant le même ordre de perforation que celui utilisé lors de la distribution des solutions. Essuyez l’aiguille entre les solutions pour éviter toute contamination croisée.

Retournez la plaque et perforez les puits sur le fond. Lisez l’absorbance de la plaque à 630 nanomètres sans couvercle. Placez un couvercle interne sur le film d’étanchéité supérieur pour vous assurer que les anneaux de condensation entourent les puits perforés, puis placez le couvercle externe sur la plaque.

Placez la plaque d’alimentation face vers le haut sur le coupleur de manière à ce que les guides alignent les trous appropriés de la plaque d’alimentation et de la plaque de famine. Assurez-vous que l’attelage et les plaques sont correctement orientés. Une fois que toutes les plaques d’alimentation sont chargées sur les coupleurs, ouvrez les puits pour les plaques en ajustant les bandes de barrière sur l’attelage.

Placez les assemblages d’attelage et de plaque dans le récipient secondaire. Placez la moitié inférieure d’une pipette contenant des serviettes en papier trempées dans chaque récipient secondaire pour fournir de l’humidité. Fermez le couvercle du récipient secondaire et transférez-le dans un environnement contrôlé.

Laissez les mouches consommer pendant 22 heures. Après les 22 heures d’exposition, vérifiez chaque plaque pour les mouches mortes et mettez à jour la disposition de la plaque en conséquence. Après avoir vérifié toutes les plaques, anesthésiez les mouches en masse en pompant du CO2 à l’intérieur du récipient secondaire.

Après environ 60 secondes, assurez-vous que toutes les mouches sont immobilisées. Tapotez doucement les mouches dans la plaque de famine et remplacez les bandes de barrière en plastique. Retirez les plaques d’alimentation pour la lecture.

Relisez l’absorbance de la plaque à 630 nanomètres. Répétez le processus jusqu’à ce que toutes les plaques aient été lues. L’évaporation a été quantifiée pour chaque puits et a été trouvée pour déterminer s’il existe des corrélations entre les puits de plaques individuelles.

Les coefficients de corrélation de Pearson pour l’évaporation par rapport aux rangées et l’évaporation par rapport aux colonnes ont été calculés pour évaluer les tendances entre l’évaporation et l’emplacement des puits. La consommation de mouches Canton-SB âgées de trois à cinq jours a été quantifiée afin d’établir la validité du protocole. Les mouches ont eu le choix entre une solution de saccharose à 4% avec 1% d’extrait de levure et une solution de saccharose à 4% complétée par de l’éthanol à 15% et de l’extrait de levure à 1%.

Les hommes et les femmes ont montré une préférence écrasante pour la solution avec de l’éthanol et de l’extrait de levure. Il est essentiel de maintenir la cohérence lors de la construction des plaques d’alimentation, en veillant à ce que chaque mouche présente un scénario de consommation identique en ce qui concerne le volume de nourriture, l’évaporation et l’accès. Cette technique permettra aux chercheurs dans le domaine de la drosophile d’effectuer des tests à haut débit pour les comportements de consommation et de préférence avec un débit plus élevé et à un coût inférieur à celui des méthodes traditionnelles.