Name: Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Apprenez à préparer des grilles d'échantillons à haute température pour la cryo-microscopie électronique. Cette méthode permet d'étudier les structures protéiques dépendantes de la température jusqu'à 70 °C.

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Les auteurs remercient le Dr Hervé Remigy de Thermo Fisher Scientific pour ses précieux conseils. Les expériences cryo-EM ont été réalisées à l’Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). L’ASCEM est soutenue par l’Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) et Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Les auteurs remercient également Mme Hui-Ju Huang pour son aide dans la préparation des échantillons.

NOTE: Ce protocole vise à utiliser un appareil de vitrification commerciale modifié pour préparer les échantillons de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à des températures spécifiques, en particulier supérieures à 37 ° C. La configuration expérimentale globale est illustrée à la figure 1. Le protocole utilise 55 °C comme exemple. Pour les conditions spécifiques à d’autres températures, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 2 de la référence12.
1. Préparation de l’appareil de vitrification
<ol><li>Faites un trou de 1 cm dans un tube centrifuge de 50 ml à son extrémité fermée.</li>
	<li>Placer le tube dans la chambre de l’appareil de vitrification à la sortie d’eau ultrasonique, comme indiqué à la figure 2. REMARQUE: Le but est de minimiser la condensation de l’eau en guidant la vapeur d’eau vers l’échangeur de chaleur à travers le tube avant d’atteindre toute la chambre.</li>
	<li>Régler la température de l’appareil de vitrification à la température spécifiée (par exemple, 55 °C, comme illustré à la figure 3) et laisser la chambre de l’appareil de vitrification atteindre 55 °C et 100 % d’humidité relative. Laissez reposer pendant au moins une demi-heure pour stabiliser les conditions avant de commencer l’expérience.</li>
</ol>2. Réchauffer l’échantillon et les outils
<ol><li>Placez le bain-marie sur une plaque chauffante et réglez la plaque chauffante à la température souhaitée (ici 55 °C). Vérifiez avec un thermomètre que l’eau atteint 55 °C.</li>
	<li>Incuber l’échantillon au bain-marie et préchauffer l’embout de la pipette sur le bord de la plaque chauffante pendant 2 minutes ou plus avant l’expérience de buvardage. REMARQUE: Le réglage de température le plus élevé pour la chambre de l’appareil de vitrification est de 60 ° C. Pour préparer des grilles de température plus élevées pour l’expérience cyro-EM (par exemple, 70 °C), l’échantillon est incubé dans le bain-marie à 80 °C, et la moyenne entre la température de l’échantillon et la température de l’appareil de vitrification est estimée à la température réelle de l’échantillon sur la grille (70 °C dans ce cas). Voir la section Discussion pour plus de détails et les limites de cette estimation.</li>
</ol>3. Préparation à l’expérience de buvard
<ol><li>Décharge luminescente d’une grille supportée par du carbone à 25 mA pendant 30 s, ou alternative aux valeurs en fonction du dispositif utilisé.</li>
	<li>Incuber la pince à épiler avec la grille dans l’appareil de vitrification pendant 2 minutes ou plus.</li>
	<li>Remplissez le récipient d’éthane avec de l’éthane selon les procédures standard. Ne laissez pas l’éthane déborder. REMARQUE: Cette étape prend environ 10 minutes et doit être suivie immédiatement avec l’expérience de buvard pour éviter le gel.</li>
	<li>Placez le papier filtre de vitrification dans la chambre de l’appareil de vitrification au plus tôt 5 minutes avant l’expérience de buvardage. REMARQUE: Placer le papier filtre dans la chambre trop tôt le rendra trop humide.</li>
</ol>4. Expérience de buvard
REMARQUE : Lorsque vous tenez la grille, assurez-vous qu’elle est stable et qu’il y a une zone de contact minimale avec la pince à épiler (Figure 4). Ceci est fait pour maintenir la meilleure efficacité de refroidissement de l’éthane et pour éviter la glace non vitreuse.
<ol><li>Utilisez une pointe de pipette pour appliquer 7 à 9 μL de l’échantillon sur la grille. Ensuite, attendez 1-2 s, épongez pendant 1-1,5 s et plongez rapidement l’échantillon à l’éthane liquide.</li>
	<li>Transférez la grille de l’éthane liquide à la boîte cryogénique, qui est stockée dans de l’azote liquide. REMARQUE: Cette étape doit être effectuée très soigneusement car la pince à épiler est encore chaude, de sorte que tout le réservoir de refroidissement est plein de vapeur à ce moment-là.</li>
</ol>5. Contrôle de qualité des réseaux
<ol><li>Coupez les grilles et téléchargez-les sur un instrument cryo-EM.</li>
	<li>Utilisez l’écran d’affichage de l’instrument cryo-EM et la fonction de faible dose du logiciel pour examiner l’état de la glace sur la grille et la distribution de l’échantillon sur la grille. NOTE: Souvent, les grilles sont très sèches ou la couche de glace est trop épaisse. Le taux de réussite des grilles préparées à haute température est nettement inférieur à celui à température ambiante ou à 4 °C. Les résultats représentatifs des bonnes grilles et des grilles non satisfaisantes sont présentés dans la section suivante.</li>
	<li>Si la qualité de la grille résultante n’est pas bonne, répétez le processus de préparation de la grille avec des conditions variées (telles que le temps d’attente, le temps de buvardage, etc.). Si la qualité de la grille résultante est bonne, répétez les mêmes étapes pour créer des grilles à une température différente.</li>
</ol>6. Collecte des données
<ol><li>Transférer les grilles de bonne qualité sur un instrument cryo-EM haute résolution.</li>
	<li>Effectuer la collecte et l’analyse des données selon les procédures établies. REMARQUE: Comme indiqué dans notre publication précédente, la résolution de la structure n’est pas affectée par la température élevée12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

À l’étape 1 du protocole, assurez-vous que le tube de centrifugation a été bien installé et ne tombe pas lorsque l’expérience est en cours. En raison de l’accumulation d’un grand nombre de gouttelettes d’eau dans la chambre, ce qui pourrait modifier la capacité d’adsorption du papier filtre, il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes après que la chambre de l’appareil de vitrification ait atteint la température d’équilibre. Si le temps de fonctionnement dépasse 30 min, l’opérateur doit remplacer le papier filtre et ...

La technologie cryo-EM pour résoudre les structures des complexes protéiques a continué à s’améliorer, en particulier dans le sens de l’obtention de structures à haute résolution 1,2. Entre-temps, le paysage de son application a également été élargi en variant les conditions d’échantillon telles que le pH ou les ligands avant le processus de vitrification3, qui implique la préparation de grilles d’échantillons suivie de la congélationplongeante 4,5. Une autre condition importante est la température. Bien que les expériences cryo-EM, comme la cristallographie aux rayons X, soient effectuées à basse température, la structure résolue par cryo-EM reflète la structure à l’état de solution avant la vitrification. Jusqu’à récemment, la majorité des études cryo-EM d’analyse par particules uniques (SPA) utilisent des échantillons conservés sur de la glace (c.-à-d. à 4 °C) avant la vitrification6, bien qu’un certain nombre d’études utilisent des échantillons à une température ambiante d’environ 7,8,9,10 ou aussi élevée que 42 °C 11. Dans un rapport récent, nous avons effectué des études dépendantes de la température de l’enzyme cétol-acide réductatosomerase (KARI) de l’archéon thermophile Sulfolobus solfataricus (Sso) à six températures différentes de 4 ° C à 70 ° C12. Nos études suggèrent qu’il est important de préparer des grilles d’échantillons à des températures fonctionnellement pertinentes et que la cryo-EM est la seule méthode structurelle pratiquement réalisable pour résoudre la structure du même complexe protéique à plusieurs températures.
La principale difficulté pour la vitrification à haute température est de minimiser la condensation de vapeur et d’obtenir de la glace mince. Nous rapportons ici le protocole détaillé utilisé pour préparer des grilles d’échantillons à haute température dans notre étude précédente du Sso-KARI 12. Nous supposons que les lecteurs ou les téléspectateurs ont déjà de l’expérience dans les procédures globales de préparation des échantillons et de traitement des données pour les expériences cryo-EM et mettons l’accent sur les aspects pertinents pour les températures élevées.

<table><tbody><tr><td>Tube</td><td>Falcon Falcon</td><td>352070</td><td>format : 50 mL</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash ; 55/20mm, Grade 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Bain-marie</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>K100X</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td></td><td>décharge luminescente</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu</td><td>grid Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>imagerie à faible dose</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Vitrobot Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de grilles d’échantillons à haute température pour cryo-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Les grilles d’échantillons pour les expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) sont généralement préparées à une température optimale pour le stockage d’échantillons biologiques, principalement à 4 °C et parfois à température ambiante. Récemment, nous avons découvert que la structure protéique résolue à basse température peut ne pas être fonctionnellement pertinente, en particulier pour les protéines d’archées thermophiles. Une procédure a été développée pour préparer des échantillons de protéines à des températures plus élevées (jusqu’à 70 ° C) pour l’analyse cryo-EM. Nous avons montré que les structures provenant d’échantillons préparés à des températures plus élevées sont fonctionnellement pertinentes et dépendent de la température. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à haute température, en utilisant 55 °C comme exemple. L’expérience a utilisé un appareil de vitrification modifié à l’aide d’un tube de centrifugation supplémentaire, et les échantillons ont été incubés à 55 ° C. Les procédures détaillées ont été affinées pour minimiser la condensation de vapeur et obtenir une fine couche de glace sur la grille. Des exemples d’expériences réussies et infructueuses sont fournis.

La vue d’ensemble du faible grossissement est illustrée à la figure 5A,B. Le panneau A est un exemple de grille réussie. Il y a un gradient de glace du haut à gauche (plus épais) au bas à droite (plus mince ou vide). Une telle grille facilite la recherche d’une épaisseur appropriée de la couche de glace dans la zone médiane adaptée à la collecte de données, comme les cases bleue et verte. La grille B est trop sèche. Les carrés de la grille ont un contraste lumineux, ce qui s...

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.

Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Les fonctions des protéines dépendent de la température et sont optimales à la température. Ce protocole fournit un moyen de résoudre les structures protéiques à des températures plus élevées. Cette approche peut fournir des structures fonctionnellement pertinentes et améliorer la compréhension de la dépendance à la température des structures protéiques.Yuan-Chih Chang, directeur de l’installation Academia Sinica Cryo EM, fera la démonstration de la procédure. Commencez par faire un trou d’un centimètre dans un tube centrifuge de 50 millimètres à son extrémité fermée. Placez le tube dans la chambre de l’appareil de vitrification à la sortie d’eau à ultrasons.Réglez la température de l’appareil de vitrification à la température spécifiée et laissez la chambre de l’appareil de vitrification atteindre 55 degrés Celsius et 100% d’humidité relative. Laissez reposer pendant au moins une demi-heure pour stabiliser les conditions avant de commencer l’expérience. Placez le bain-marie sur une plaque chauffante et réglez la plaque chauffante à la température désirée.Vérifiez avec un thermomètre pour vous assurer que l’eau atteint 55 degrés Celsius. Incuber l’échantillon au bain-marie et préchauffer l’embout de la pipette sur le bord de la plaque chauffante pendant deux minutes ou plus avant l’expérience de buvardage. Décharge luminescente une grille supportée par du carbone troué à 25 milliampères pendant 30 secondes.Placez le papier filtre de vitrification dans la chambre de l’appareil de vitrification au plus tôt cinq minutes avant l’expérience de buvardage. Incuber la pince à épiler avec la grille dans l’appareil de vitrification pendant deux minutes ou plus. Construisez le récipient d’éthane avec de l’éthane selon les procédures standard, en veillant à ce que l’éthane ne déborde pas.Utilisez une pipette pour appliquer sept à neuf microlitres de l’échantillon sur la grille. Ensuite, attendez une à deux secondes, épongez pendant une à une seconde et demie et plongez rapidement l’échantillon dans de l’éthane liquide. Transférer la grille de l’éthane liquide à la boîte cryogénique stockée dans de l’azote liquide.Coupez les grilles et déchargez-les pour acquérir un microscope électronique ou un instrument Cryo EM. Utilisez l’écran d’affichage de l’instrument Cryo EM et la fonction de faible dose du logiciel pour examiner l’état de la glace sur la grille et la distribution de l’échantillon sur la grille. Si la qualité de la grille résultante n’est pas bonne, répétez le processus de préparation de la grille avec des conditions variées telles que le temps d’attente, le temps de buvardage, etc.Si la qualité de la grille résultante est bonne, répétez les mêmes étapes pour créer des grilles à une température différente. Transférez les grilles de bonne qualité sur un instrument Cryo EM haute résolution. Effectuer la collecte et l’analyse des données selon les procédures établies.Dans le cas de la grille réussie, un gradient de glace s’est formé avec de la glace plus épaisse en haut à gauche de la grille et de la glace plus mince en bas à droite. Des cases bleues et vertes convenant à la collecte de données ont été observées dans la grille de réussite. Un contraste lumineux a été observé dans l’autre grille.Indiquant une fine couche de glace ou une absence de glace. Seuls deux carrés se sont révélés appropriés pour la collecte de données dans la deuxième grille. L’une des grilles était constituée de glace principalement sous forme cristalline, ce qui ne convenait pas à la collecte de données.D’autre part, l’autre grille a montré que la couche de glace était principalement dans un état amorphe adapté à la collecte de données. La préparation du conteneur et d’autres doivent être terminées en fonction d’un point de temps. Le contrôle du temps et la finition rapide et précise de l’expérience sont les plus importants.Selon les résultats obtenus à l’aide de ce protocole, le chercheur devra peut-être être plus prudent dans la mise en place des conditions simples.

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