Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette pour capturer des images du champignon modèle aspergillus nidulans, en utilisant des techniques de microscopie à lumière transmise. Nous utilisons ces images pour analyser et quantifier la cinétique de croissance d’aspergillus nidulans dans des milieux liquides et solides. Une représentation visuelle de ce protocole permet aux utilisateurs de se familiariser avec les étapes importantes de la capture d’images et du traitement d’images par microscopie.

Une méthode couramment utilisée pour mesurer la croissance fongique filamenteuse consiste à utiliser deux spores fongiques inoculées dans une boîte de Pétri contenant une gélose nutritive et à mesurer le diamètre de la colonie en développement quelques jours plus tard. Cependant, cette approche n’est pas assez sensible pour quantifier les différences de croissance fines. Par conséquent, des mesures unicellulaires utilisant la microscopie en accéléré ont été développées.

Ces mesures sont capables non seulement de fournir des résultats précis et quantitatifs, mais aussi de refléter la dynamique de croissance de différentes cellules au sein d’une population. De plus, cette approche vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les réponses de croissance fongique aux signaux endogènes et environnementaux. Commencez par verser 15 millilitres de gélose nutritive liquide dans des boîtes de Pétri.

Placez le couvercle sur le dessus et laissez-le refroidir. Utilisez le rayonnement UV pour stériliser les plaques. Avant d’éliminer la souche fongique d’intérêt d’un bouillon, chauffez la boucle nodulante dans le brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’elle soit rouge, refroidissez la boucle en la poignardant dans la gélose.

Vortex le tube et striquer la boucle à travers la surface du milieu minimal de la gélose complété par les besoins nutritionnels appropriés. Incuber des plaques pendant deux à trois jours à 37 degrés Celsius. À l’aide d’un cure-dent stérile, transférez un petit nombre de conidies en touchant doucement une seule colonie sur des plaques de milieu complet.

Incuber des plaques pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius. Les conidies d’aspergillus nidulans sont récoltées dans un tube vortex stérile de 1,5 millilitre, avec 1,0 millilitre d’eau distillée en autoclave contenant 0,05% de volume par volume, Tween 80, pour réduire le nombre d’amas de conidies. Une version modifiée de la méthode de la gélose inversée est utilisée pour l’imagerie des champignons filamenteux sur la surface du milieu gélose.

Repérez initialement 10 aliquotes microlitres de suspension conidiale vortex vigoureuse, environ deux fois 104 cellules par millilitre sur des boîtes de Pétri de 15 millilitres de milieu minimal avec un poids par volume de gélose. Incuber la culture expérimentale en fonction du stade de développement à étudier. Ici, nous incubons pendant trois jours à 30 degrés Celsius.

Ensuite, découpez un bloc de gélose contenant la colonie, à l’aide d’un scalpel stérile. Ici, nous coupons un coin de gélose à la marge de la colonie, inversons et plaçons la tranche de gélose dans un huit, bien glisser. Transférer 10 aliquotes de microlitres de suspension conidiale vortex vigoureuse d’environ deux fois 10 dans la puissance de quatre dans les puits d’une lame de puits contenant 200 microlitres de milieu minimal avec les suppléments appropriés.

Incuber pour le temps et la température à examiner à chaque fois. Le choix du microscope dépend de l’équipement disponible. Dans tous les cas, la configuration du microscope doit inclure un étage inversé, une chambre environnementale ou au moins une pièce avec un contrôle précis de la température de l’air.

Préchauffez d’abord le thermostat et la chambre du microscope pour stabiliser la température souhaitée. Ici, nous avons réglé la température à 30 degrés Celsius. Allumez le microscope, la puissance du scanner, l’alimentation laser et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie.

Placez la lame de puits préalablement préparée dans la scène du microscope et faites la mise au point. Trouvez des champs de vision qui contiennent des cellules isolées, qui ne se chevauchent pas, ou du moins qui ne sont pas surpeuplées, pour faciliter les mesures de croissance lors de l’analyse d’images. Sélectionnez la technique de microscopie à lumière transmise à utiliser et activez le détecteur de lumière transmise ainsi que les détecteurs de fluorescence si nécessaire.

Réglez le microscope pour acquérir des images aux intervalles de temps souhaités et commencer l’acquisition de séries chronologiques. Le chargement, la visualisation et le traitement des images sont effectués avec le logiciel open source imageJ Fiji. Commencez par importer les images aux Fidji à l’aide de plugins par un format.

Sélectionnez le mode de couleur par défaut et la mise à l’échelle automatique. Afin de visualiser un horodatage et une barre d’échelle comme superposition aller à l’analyse, outils, barre d’échelle. Définissez les paramètres souhaités concernant la largeur, la hauteur, la couleur et l’emplacement de la barre d’échelle.

Accédez à image, propriétés, pour afficher les propriétés de l’image dans le logiciel imageJ Fiji. Observez les informations d’intervalle de trame. Ici, nous utilisons un intervalle de temps d’environ 15 minutes et appuyons sur OK.

Ensuite, accédez à l’image, aux piles, à l’étiquette et définissez les informations correctes sur intervalle. Définissez l’emplacement de l’étiquette en modifiant X et Y.Définissez l’unité de mesure dans le texte du champ et appuyez sur Aperçu. Utilisez la correspondance d’histogramme pour la correction de l’éclairage entre différentes images en sélectionnant l’image, l’ajustement, la correction de l’eau de Javel, la correspondance de l’histogramme.

Une nouvelle fenêtre avec éclairage corrigé apparaît. Utilisez le plugin MtrackJ dans les plugins, MtrackJ, pour suivre la pointe hyphale en croissance Pour ajouter la piste, sélectionnez le bouton Ajouter dans la barre d’outils et placez le premier point à la pointe hyphale en utilisant le clic gauche de la souris. La série chronologique passera automatiquement à l’image suivante.

Pour terminer le processus de suivi, double-cliquez sur la souris sur le point final ou appuyez sur la touche d’échappement. Faire défiler la table de sortie, la colonne la plus importante pour calculer la croissance de la pointe hyphale, est la vitesse à une image donnée. Suivez en toute sécurité les mesures, ajoutez un fichier, enregistrez sous, au format de fichier de votre choix, par exemple, CSV, importez le fichier enregistré dans votre tableur et calculez la visualisation et d’autres tests.

Appuyez sur le bouton vidéo pour générer un film, de type couleur RVB, contenant les images avec les pistes dessinées, qui peut être visualisé dans n’importe quel lecteur multimédia standard. En suivant ce protocole, nous avons capturé et analysé diverses images correspondant à différents stades de croissance et de développement du champignon filamenteux aspergillus nidulans. La figure montre la comparaison des mesures du taux de croissance de type sauvage et azhAD Delta ngnA Delta.

L’azhAD Delta ngnA Delta est une souche double supprimée dans deux gènes impliqués dans la désintoxication et l’assimilation du produit combattant toxique L tel qu’ajouté dans deux acides carboxyliques. Il montre des mesures statistiquement significatives du taux de croissance inférieur par rapport à la souche de type sauvage dans les cultures liquides submergées. Cette différence de croissance n’est pas détectable en mesurant la superficie de la colonie de ces deux souches dans un milieu minimal solide.

L’imagerie à long terme à longue durée sur une seule cellule est d’une grande valeur dans l’effort visant à obtenir des informations spatiales et temporelles sur la dynamique des protéines cellulaires. Ce protocole convient également à la réalisation d’imagerie de cellules vivantes à long terme. Ici, nous voyons la germination de conidies co-exprimant la protéine eisosomale pilA de base étiquetée GFP et l’histonène h1 mRFP. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la cinétique de croissance fongique de manière reproductible et fiable sans avoir besoin d’une expérience préalable d’analyse d’image de la part de l’utilisateur.

Ce protocole permet une quantification objective et précise de la croissance fongique.