Name: Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Découvrez un système de culture d'organes intestinaux pour analyser les interactions hôte-microbiote ex vivo. Cette méthode combine contrôle expérimental rigoureux et préservation de la physiologie intestinale.

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Nous remercions les membres passés et présents du laboratoire Yissachar pour leurs précieuses contributions à l’optimisation du protocole du système de culture d’organes intestinaux. Nous remercions Yael Laure pour l’édition critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 3114831), la Fondation scientifique israélienne - Programme conjoint du Broad Institute (subvention n° 8165162) et le Fonds Gassner pour la recherche médicale, Israël.

Ce protocole suit les lignes directrices en matière de soins aux animaux approuvées par le comité d’éthique pour le bien-être des animaux.
1. Préparation de l’expérience
<ol><li>Fabrication du dispositif de culture d’organes intestinaux (3 jours)<ol>
<li>À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez les moules en plastique réutilisables pour le dispositif de culture d’organes (l’appareil a 6 puits, avec 24 petits et grands trous, et pour le couvercle du couvercle de l’appareil) (fichiers 3D joints). REMARQUE: Ces moules en plastique peuvent être utilisés pour la fabrication de nombreux appareils.</li>
		<li>Insérez les aiguilles à extrémité émoussée (22 G et 18 G) à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 g de mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) (rapport poids 1:10, base/catalyseur) pour un ensemble de l’appareil et du couvercle.</li>
		<li>Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 min, pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS.</li>
		<li>Incuber les moules à 55 °C pendant la nuit, pour compléter la polymérisation PDMS.</li>
		<li>Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique.</li>
		<li>Retirez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale. Fixez le dispositif PDMS et le couvercle de l’appareil sur un verre de couverture (micro-lames de 75 mm x 50 mm) à l’aide d’un adhésif au silicium non toxique et laissez les pièces se fixer pendant la nuit (appliquez la colle sur le côté lisse de l’appareil).</li>
		<li>Insérez douze aiguilles de 22 G pour la lumière et douze aiguilles de 18 G pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les se fixer pendant la nuit. Insérez deux aiguilles de 18 G dans le couvercle du couvercle pour une bonne circulation de l’air à l’intérieur et à l’extérieur du dispositif de culture d’organes intestinaux.</li>
		<li>Vérifiez toutes les aiguilles pour les fuites à l’aide d’une seringue remplie d’eau. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite des puits en remplissant les puits d’eau.</li>
		<li>Placez deux nœuds chirurgicaux sur chaque aiguille de 22 G qui sera reliée au côlon. Placez l’appareil et le couvercle dans un sac en papier autoclave et stérilisez-le dans un autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Milieu de culture (0,5 h)<ol>
<li>Dans une hotte biologique, mélanger les éléments suivants (dans un tube de 50 mL) : 37 mL de milieu de Dulbecco modifié (IMDM) d’Iscove, 10 mL de remplacement sérique de KSR, 1 mL de supplément de B27, 0,5 mL de supplément de N2, 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M et 0,5 mL d’acides aminés non essentiels.</li>
		<li>Filtrer et conserver le milieu complet à 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des tubes et des outils chirurgicaux<ol>
<li>Coupez la longueur appropriée des tubes pour le lumen d’entrée, le puits d’entrée, le lumen de sortie et le puits de sortie (12 tubes courts et 12 tubes longs). Connectez un adaptateur approprié de chaque côté du tube.</li>
		<li>Préparez les outils chirurgicaux: ciseaux droits, 4x pinces minces et 2x pinces pointues.</li>
		<li>Placez les tubes et les outils chirurgicaux dans un sac en papier autoclave et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer l’apport luminal (stimulation souhaitée - bactéries, selles, médicaments, etc.).<ol>
<li>Avant l’expérience, déterminer la charge bactérienne de la culture bactérienne, par dilutions en série12, et la culture dans des conditions aérobies et/ou anaérobies.</li>
		<li>Après avoir calculé la charge bactérienne, diluer les cultures bactériennes dans un milieu de culture tissulaire stérile pour obtenir la concentration bactérienne requise. Pour les échantillons fécaux, filtrer à l’aide d’une passoire de 100 μm. REMARQUE: Pour la stimulation non bactérienne (médicaments, métabolites, etc.), diluer la substance à la concentration requise en utilisant le milieu de culture intestinal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de la configuration de l’expérience
<ol><li>À l’intérieur de l’incubateur de culture d’organes, allumez l’unité de chauffage et réglez-la à 37 ° C.</li>
	<li>Installez les pompes ainsi que les seringues d’entrée et de sortie.</li>
	<li>Entrée de milieu de culture tissulaire<ol>
<li>Dans une hotte à écoulement biologique ou laminaire, remplissez les seringues du puits d’entrée avec un milieu de culture complet. Le volume final dépend de la durée de l’expérience et du débit ; habituellement 1 mL/h plus un milieu supplémentaire pour la purge.</li>
		<li>Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pompes à seringues.</li>
		<li>Purgez les seringues d’entrée. Assurez-vous que le milieu du puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entrée luminale<ol>
<li>Remplissez les seringues d’entrée luminale avec un traitement de stimulation (bactéries, médicaments, etc.). Le volume dépend de la durée de l’expérience et du débit (généralement 30 μL/h plus milieu supplémentaire pour la purge).</li>
		<li>Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pompes à seringues.</li>
		<li>Purger les seringues d’entrée. Assurez-vous que la stimulation s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé. Attention à ne pas contaminer les différentes stimulations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorties<ol>
<li>Placez les seringues vides dans les pompes à seringues de sortie (réglez le mode pompe sur « retrait »).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuration de l’appareil<ol>
<li>Réglez le régulateur qui contrôle le débit du mélange de gaz (95% O2 + 5% CO2)pour un débit doux et minimal.</li>
		<li>Examinez l’appareil dans une hotte laminaire.</li>
		<li>Rincez les aiguilles de l’appareil avec de l’IMDM stérile pour laver les aiguilles.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de milieu de culture stérile dans chaque puits de l’appareil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation à la dissection tissulaire<ol>
<li>Placez les outils chirurgicaux stériles à l’intérieur de la hotte laminaire.</li>
		<li>Remplissez une seringue de 10 mL avec de l’IMDM stérile et connectez une aiguille stérile (autoclavée) à extrémité émoussée de 22 G pour le rinçage du côlon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultures d’organes
<ol><li>Sacrifice de souris et dissection tissulaire<ol>
<li>Dans une hotte laminaire, sacrifiez des souris âgées de 12 à 14 jours par décapitation. Vaporisez les souris avec 70% d’éthanol et placez les souris sur une plaque en plastique.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux et de pinces tranchants, disséquez la souris et retirez le tube digestif de l’estomac à l’anus en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette. REMARQUE: Minimiser le contact avec le tissu du côlon. Ne touchez pas la partie centrale du tissu du côlon. Tenez le tissu doucement et seulement sur les bords du tissu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rinçage et lavage du côlon<ol>
<li>Sous un microscope à dissection, rincer doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile (dans le côté proximal) avec la seringue préparée de 10 mL (étape 2.7.2). Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque de 6 puits remplie de 0,5 mL de DMI stérile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Connexion du côlon à l’appareil<ol>
<li>Prenez le tissu et connectez-le soigneusement sur l’aiguille de 22 G et faites une cravate serrée avec les deux fils. À ce stade, il est impératif de maintenir l’orientation correcte du côlon par le flux lumineux (proximal = entrée, distal = sortie). Répétez les étapes 3.2 à 3.3 pour les 6 tissus.</li>
		<li>Vérifiez que les verrous Luer de l’aiguille d’entrée sont vides du support. Sinon, videz-les. Ajoutez des stimulations à l’aiguille d’entrée Luer lock (pour éviter l’entrée de bulles d’air dans la lumière). Répétez cette étape pour chaque côlon avec la stimulation appropriée.</li>
		<li>Vérifiez que tous les tissus sont connectés et placez le couvercle du couvercle sur le dessus de l’appareil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Connexion du dispositif de culture d’organes aux pompes<ol>
<li>Placez l’appareil dans la chambre préchauffée à température contrôlée (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Connecter le flux de gaz<ol>
<li>Connectez l’adaptateur de gaz au couvercle du couvercle à l’aide de l’aiguille d’entrée appropriée.</li>
		<li>Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil. REMARQUE: Connectez le côté proximal du côlon aux bacs d’entrée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purgez la lumière avec les entrées de stimulation.<ol>
<li>Appliquez doucement la stimulation luminale à travers l’intestin et vérifiez l’écoulement du milieu dans les tubes de sortie.</li>
		<li>Laver le support externe.</li>
		<li>Lavez le milieu externe 3 fois (réglez les pompes à une vitesse de 600 μL/min pour bien entrer et sortir). Chaque lavage dure 1 min (en commençant par vider le puits).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Démarrez l’expérience.<ol>
<li>Démarrez les pompes aux taux suivants : Débit: lumen: entrée- 30 μL / h, sortie- 35 μL / h Milieu externe: entrée- 1000 μL / h, sortie - 950 μL / h REMARQUE: Le temps d’expérience peut varier entre 30 min et 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fin de l’expérience (jusqu’à 24 h pour les cultures d’organes du côlon)<ol>
<li>Déconnectez tous les tubes de l’appareil.</li>
		<li>Débranchez les tissus des aiguilles et continuez jusqu’aux lectures souhaitées.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
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<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
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<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article décrit un protocole optimisé pour les cultures d’organes intestinaux ex vivo que Yissachar et al. ont récemment développé (publié9 et données non publiées). Le système de culture d’organes intestinaux prend en charge la culture multiplexée de fragments intestinaux intacts tout en maintenant le flux luminal. Il offre un contrôle total sur l’environnement intra et extra-luminal (y compris la dose de stimulation, le temps d’exposition et le débit) et préserve la structure naïve d...

L’intestin est un organe très complexe contenant un large éventail de types cellulaires (cellules épithéliales, cellules du système immunitaire, neurones, etc.) organisés dans une structure particulière qui permet aux cellules d’interagir et de communiquer entre elles et avec le contenu luminal (microbiote, nourriture, etc.) 1. Actuellement, la boîte à outils de recherche disponible pour l’analyse des interactions hôte-microbiote comprend des cultures cellulaires in vitro et des modèles animaux in vivo 2. Les modèles animaux in vivo fournissent une construction tissulaire physiologique3 mais avec un mauvais contrôle expérimental et une capacité limitée à manipuler les conditions expérimentales. Les systèmes de culture in vitro, d’autre part, utilisent des cellules primaires ou des lignées cellulaires qui peuvent être complétées par des microbes4,offrant un contrôle étroit sur les paramètres de l’expérience mais dépourvus de complexité cellulaire et d’architecture tissulaire. Les essais in vitro modernes permettent l’utilisation avancée d’échantillons de tissus humains sains et pathologiques, comme les organoïdes épithéliaux dérivés de sources souris ou humaines5,6, et des échantillons qui imitent le microenvironnement muqueux7. Un autre exemple est le test « intestin sur puce », qui comprend la lignée cellulaire épithéliale du côlon humain (Caco2), la matrice extracellulaire et les canaux microfluidiques pour imiter l’état physiologique de l’invariant intestinal8. Cependant, aussi avancés et innovants que puissent être les échantillons in vitro, ils ne maintiennent pas une architecture tissulaire normale ou une composition cellulaire naïve.
Pour y remédier, Yissachar et al. ont récemment mis au point un système de culture d’organes ex vivo 9 (Figure 1)qui maintient des fragments intestinaux intacts ex vivo,bénéficiant des avantages des modèles in vivo et in vitro. Ce système de culture d’organes intestinaux ex vivo est basé sur un dispositif de culture sur mesure qui prend en charge une culture multiplexée de six tissus du côlon, permettant d’examiner les entrées expérimentales dans des conditions comparables tout en contrôlant les entrées et les sorties du système. Des travaux récents ont démontré que ce système est précieux pour analyser les réponses intestinales aux bactéries intestinales individuelles9,aux échantillons de microbiote humain entier10 et aux métabolites microbiens11. Ce système permet, pour la première fois, l’étude de ces interactions précoces hôte-microbiote avec un haut niveau de contrôle sur l’hôte, les composants microbiens et environnementaux. De plus, il permet de surveiller et de manipuler le système tout au long de l’expérience, en temps réel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Figure 1: Schémas du dispositif de culture intestinale. Un fragment entier de tissu intestinal est attaché aux orifices de sortie et d’entrée de la chambre (en haut), avec des pompes régulant le flux de fluide à l’intérieur de la lumière et dans la chambre de milieu externe. L’ensemble de l’appareil (en bas) contient 6 chambres de ce type. Ce chiffre a été modifié à partir de Yissachar et al. 2017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Aiguille émoussée</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée de calibre 22</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif tout usage Selant 100 % silicone</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur cubique sous vide VDC-21+ 2 étagères</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>Diapositive en verre 1 mm d’épaisseur</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini incubateur im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E POMPE</td><td></td> à vide <td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons d’accouplement de tube à rotation rapide en plastique</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>Douilles d’accouplement de tube à rotation rapide en plastique</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Élastomère de silicone</td><td>Dow</td><td></td><td>Polydiméthylsiloxane, Tube PDMS</td></tr><tr><td></td><td>Mcmaster</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Matériaux : z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), Sans sérum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon 17504044 HEPES (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove avec rouge de phénol (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028 Supplément N2</td><td></td></tr><tr><td>(100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Non Acide aminé essentiel (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Scissors</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>Fil chirurgical tressé en soie</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux droits</td><td>F.S.T</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince mince</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Organ System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 & micro ; m Filtre</td> Gène <td></td><td></td><td>de la vie</td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Filter</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Seringue Luer Lock</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique Greenough</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Réchauffeur d’air de précision à recirculation « CUBE"CUBE-2-LIS</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Seringue Pompe</td><td>New Era Pump Systems inc</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

La structure du tissu intestinal facilite les interactions étroites et mutualistes entre l’hôte et le microbiote intestinal. Ces pourparlers croisés sont cruciaux pour maintenir l’homéostasie locale et systémique; les modifications de la composition du microbiote intestinal (dysbiose) sont associées à un large éventail de maladies humaines. Les méthodes de dissection des interactions hôte-microbiote englobent un compromis inhérent entre la préservation de la structure physiologique des tissus (lors de l’utilisation de modèles animaux in vivo) et le niveau de contrôle des facteurs expérimentaux (comme dans les systèmes de culture cellulaire in vitro simples). Pour remédier à ce compromis, Yissachar et al. ont récemment développé un système de culture d’organes intestinaux. Le système préserve une construction naïve du tissu du côlon et des mécanismes cellulaires et il permet également un contrôle expérimental serré, facilitant les expérimentations qui ne peuvent pas être facilement effectuées in vivo. Il est optimal pour disséquer les réponses à court terme de divers composants intestinaux (tels que les éléments épithéliaux, immunologiques et neuronaux) aux perturbations luminales (y compris les microbes anaérobies ou aérobies, les échantillons de microbiote entier de souris ou d’humains, les médicaments et les métabolites). Ici, nous présentons une description détaillée d’un protocole optimisé pour la culture d’organes de plusieurs fragments intestinaux à l’aide d’un dispositif de culture intestinale sur mesure. Les réponses de l’hôte aux perturbations luminales peuvent être visualisées par coloration par immunofluorescence de coupes de tissus ou de fragments de tissus à monture entière, hybridation in situ par fluorescence (FISH) ou imagerie accélérée. Ce système prend en charge un large éventail de lectures, y compris le séquençage de nouvelle génération, la cytométrie en flux et divers tests cellulaires et biochimiques. Dans l’ensemble, ce système de culture d’organes tridimensionnel prend en charge la culture de tissus intestinaux volumineux et intacts et a de vastes applications pour l’analyse à haute résolution et la visualisation des interactions hôte-microbiote dans l’environnement intestinal local.

Le système de culture d’organes intestinaux maintient la viabilité des tissus ex vivo. L’évaluation de la viabilité des tissus a été effectuée tout au long de la période de culture. Des fragments de tissu du côlon ont été incubés dans le système de culture d’organes intestinaux et fixés après une culture de 2/12/24 h. L’intégrité de la couche de cellules épithéliales intestinales (CEI) a été validée par coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps E-cadhérine et cytokératine-18. De même, des cellules d...

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Le système de culture d’organes intestinaux combine les avantages des essais in vitro et in vivo et sert ainsi d’étape expérimentale intermédiaire entre des essais in vitro simples et des expériences in vivo complexes. Le principal avantage de cette technique est la combinaison d’un contrôle expérimental strict avec la préservation de la physiologie intestinale. Cette méthode fournit des informations pour analyser les réponses intestinales à un stimulus spécifique avec un niveau élevé de contrôle sur l’hôte, les composants microbiens et environnementaux.Alon Shemesh, un étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, et le Dr Sivan Amidror, notre directeur de laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, insérez les aiguilles à extrémité émoussée à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 grammes de mélange de polydiméthylsiloxane ou de PDMS, pour un ensemble de l’appareil et du couvercle. Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 minutes pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS, puis incubez les moules à 55 degrés Celsius pendant la nuit pour terminer la polymérisation PDMS.Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique. Retirez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale. Fixez le dispositif PDMS et le couvercle de l’appareil sur un verre de couverture de microslides de 75 par 50 millimètres à l’aide d’un adhésif au silicium non toxique et laissez les pièces se fixer pendant la nuit.Appliquez le collé sur le côté lisse de l’appareil. Insérez 12, 22 aiguilles de jauge pour la lumière et 12, 18 aiguilles de jauge pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les se fixer pendant la nuit.Purgez les seringues d’entrée et assurez-vous que le milieu du puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé, puis purgez les seringues d’entrée et assurez-vous que les stimulations s’écoulent de tous les tubes dans un verre usagé, en prenant soin de ne pas contaminer les différentes stimulations. Après avoir sacrifié la souris, utilisez des ciseaux et des pinces tranchants pour la disséquer et retirer le tube digestif de l’estomac à l’anus, en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette.Minimisez le contact tout en tenant le tissu doucement et seulement sur les bords. Effectuez le rinçage du côlon sous un microscope à dissection. Rincez doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile avec la seringue préparée de 10 millilitres comme décrit dans le texte.Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque de six puits remplie de 0,5 millilitre de DMI stérile. Ensuite, prenez le tissu du côlon et connectez-le soigneusement à l’aiguille de calibre 22, en faisant une cravate serrée avec les deux fils. Maintenez l’orientation correcte du côlon par rapport au flux lumineux, de sorte que le proximal et le distal soient égaux à l’entrée et à la sortie, respectivement.Répétez le rinçage du côlon et l’attache des aiguilles pour tous les tissus. Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil, puis commencez l’expérience en démarrant les pompes aux vitesses souhaitées. Des cellules de gobelet remplies de mucus dans l’épithélium colique et une sécrétion de mucus dans la lumière ont été détectées ainsi qu’une prolifération de ceI dans les cryptes du côlon, comme indiqué par la coloration KI67.Ces résultats ont montré que le système de culture intestinale maintient la fonction et la structure intestinales ex-vivo. Après deux heures d’introduction de bactéries filamenteuses segmentées, ou SFB, des filaments SFB typiques ont été détectés en étroite association avec les villosités de l’intestin grêle en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence. De plus, une microscopie électronique à transmission a présenté un SFB à quelques microns de la bordure de la brosse d’épithélium de l’intestin grêle.Les profils d’expression génique d’échantillons de tissus entiers ont été produits en trois exemplaires deux heures après la perfusion de SFB. Les cultures témoins ont été perfusées avec des suspensions fécales de souris monocolonisées sans germes ou Bacteroides fragilis. Ces changements persuadés par SFB étaient principalement de faible amplitude par rapport au contrôle sans germes.L’orientation du côlon est très importante. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous attachez le côlon sur l’aiguille. Une bonne attache empêchera la contamination du puits par le contenu en lumens.Un large éventail de techniques de lecture peuvent suivre ce protocole, telles que le séquençage de nouvelle génération, l’imagerie, le tri cellulaire et bien d’autres. Ces lectures fournissent de nouvelles informations sur les interactions du microbiome de l’hôte dans la santé et la maladie.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Calatayud Arroyo, M., et al. Évaluation de la viabilité d’un consortium bactérien synthétique à l’interface intestin-microbe in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo présente un modèle intestin-microbe in vitro pour étudier la viabilité bactérienne. Une co-culture de cellules Caco-2 et HT29-MTX est incubée avec des bactéries pré-traitées dans des conditions digestives simulées. L’intégrité de la barrière épithéliale est évaluée à l’aide de résistance électrique transépithéliale, et...

Modèle intestinal in vitro pour évaluer l’adhésion et l’internalisation bactériennes

Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie de mise en place d’un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions entre des fragments de tissu intestinal de souris et des bactéries intestinales spécifiques. Le dispositif se compose de deux paires de ports d'entrée-sortie, le premier connectant la lumière du tissu intestinal et y fournissant la suspension bactérienne spécifique, et le second fournissant en permanence des fluides aux puits du dispositif pour...

Un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions hôte-microbiote

Nous décrivons un protocole in vitro de co-culture gut microbiome et villosités intestinales pendant une période prolongée en utilisant un système microphysiological humain gut-on-a-chip.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

La culture d’organes ex vivo permet d’étudier les processus biologiques dans le contexte de l’architecture tissulaire intacte. Ici, nous présentons une méthode de culture ex vivo du côlon de souris, qui peut être utilisée pour étudier l’immunité innée et la défense antimicrobienne de l’hôte dans l’intestin.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture et son utilisation dans l&#39;hôte antimicrobienne études de la défense

Interactions hôtes-microorganismes gut ont été évaluées à l’aide d’une nouvelle approche combinant une communauté orale synthétique, in vitro digestion gastro-intestinale et un modèle de l’épithélium de l’intestin grêle. Nous présentons une méthode qui peut être adaptée pour évaluer l’invasion des cellules des agents pathogènes et des biofilms multi-espèces, ou même de tester la capacité de survie des probiotiques formulations.

Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

Nous présentons ici un protocole pour cultiver le microbiote intestinal du côlon in vitro, à l’aide d’une série de bioréacteurs qui simulent les conditions physiologiques du tractus gastro intestinal.

Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

Ce protocole décrit un système in vitro de fermentation par lots-culture du microbiote fécal humain, utilisant l'inuline (un prébiotique bien connu et l'un des modulateurs de microbiote les plus largement étudiés) pour démontrer l'utilisation de ce système dans l'estimation des effets de sur la composition du microbiote fécal et les activités métaboliques.

Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Notre protocole détaillé décrit la création et l’utilisation du modèle avancé d’intestin sur puce, qui simule la muqueuse intestinale humaine avec des structures 3D et divers types de cellules, permettant une analyse approfondie des réponses immunitaires et des fonctions cellulaires en réponse à la colonisation microbienne.

Modèle d’intestin sur puce immunocompétent pour l’analyse des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale

L’étude présente une méthode d’investigation in vitro des infections bactériennes à l’aide d’organoïdes intestinaux dérivés des cellules souches tissulaires. Le protocole décrit comment cultiver et différencier les organoïdes en deux dimensions, les infecter avec des Escherichia coli invasives par adhérents, et évaluer les données clés, notamment la rupture de la barrière épithéliale, l’imagerie d’infection et la réponse de l’ARN épithélial.

Une culture organoïde bidimensionnelle sur un extrait d’invasine ou de membrane basale pour étudier les interactions hôte-bactérie

Découvrez un système de culture d'organes intestinaux pour analyser les interactions hôte-microbiote ex vivo. Cette méthode combine contrôle expérimental rigoureux et préservation de la physiologie intestinale.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

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