Name: Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Apprenez à marquer les vésicules extracellulaires pour surveiller leur migration et absorption dans les explants cartilagineux par microscopie confocale. Cette méthode facilite l'étude des mécanismes de l'ostéoarthrite.

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Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124); par le PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financé par la taxe de tourisme durable des îles Baléares; par la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); par le programme postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dans le cadre du FUTURMed, financé à 50% par la taxe de tourisme durable des îles Baléares et à 50% par le FSE; et par la Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

NOTE: Les explants de cartilage ont été obtenus auprès de la biobanque IdISBa (IB 1995/12 BIO) conformément aux directives institutionnelles après approbation éthique du projet par le CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Préparation des colonnes
<ol><li>Équilibrez les colonnes en suivant les instructions du fabricant ou comme suit :<ol>
<li>Retirez le capuchon de colonne et équilibrez la colonne. Retirez le tampon de stockage par élution.</li>
		<li>Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lors de chaque lavage, attendez que la colonne absorbe tout le volume. REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher.</li>
		<li>Couvrir la colonne avec le bouchon après le dernier lavage et jusqu’à la préparation de l’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Étiquetage des véhicules électriques
REMARQUE: Ce protocole d’étiquetage EV utilise un échantillon PL-EV précédemment isolé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des conditions précédemmentdécrites21,22. Cependant, tout échantillon EV provenant de n’importe quelle source peut être utilisé avec ce protocole.
<ol><li>Concentrez l’échantillon EV et le contrôle (PBS) à l’aide d’un tube de concentration.<ol>
<li>Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 mL ou 500 μL, selon le volume de départ de l’échantillon EV de départ. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec. REMARQUE: L’échantillon de contrôle est nécessaire pour vérifier tout fond de colorant. Bien que cette méthode ne nécessite aucun volume initial spécifique, il faut considérer qu’environ 10% des particules seront perdues lors des étapes de purification.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons concentrés avec le diluant C. Remettre en suspension les échantillons EV avec 200 μL et le groupe témoin avec 100 μL et les transférer dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 mL.</li>
	<li>Séparer l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 μL. Marquez-en un avec un colorant et utilisez-le comme traitement (PKH-PL-EV); laissez l’autre non marqué, mais traitez-le (NTA-PL-EV) comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par NTA.</li>
	<li>Préparer 2x solution de colorant, résultant en une solution de PKH26 de 8 μM dans le diluant C.</li>
	<li>Mélanger 1 μL de 1 mM de liant PKH26 par 125 μL de diluant C dans l’échantillon. Préparez un volume à ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.</li>
	<li>Ajouter 2x solution de colorant à PKH-PL-EV et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration de colorant de 1x et une concentration de PKH26 de 4 μM. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon NTA-PL-EV. Incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter la solution d’albumine-PBS sérique bovine à 5 % aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 μL. REMARQUE: Cette étape permet d’éliminer les interactions de colorant non spécifiques ou de colorant non lié.</li>
	<li>Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions non spécifiques du colorant avec la colonne.</li>
</ol>3. Isolation des véhicules électriques étiquetés
<ol><li>Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 μL de l’échantillon (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou témoin) et jetez tout liquide élué.</li>
	<li>Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et jeter tout le liquide élué.</li>
	<li>Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un 1,5. Tube de centrifugeuse mL (VE ou contrôle). REMARQUE: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer l’excès de colorant des échantillons. Une autre séparation par colonne est nécessaire pour obtenir des VÉHICULES plus purs. Ainsi, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une nouvelle colonne équilibrée (étape 4.1.) ou dans la même colonne après une étape de lavage initiale (étape 4.2).</li>
	<li>Préparez la colonne pour une nouvelle étape de séparation des VE afin d’obtenir des VE plus purs. S’il s’agit d’une nouvelle colonne, répétez les étapes 2.1. et 2.2. S’il s’agit de la même colonne, lavez la colonne avec 2,5 mL d’isopropanol à 20 %, puis répétez les étapes 2.1 et 2.2.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de VÉHICULES électriques préalablement élués obtenus à l’étape 2.5 à la colonne et jeter le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Ajouter 400 μL de PBS et jeter tout le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Utilisez les véhicules électriques et les échantillons de contrôle pour d’autres analyses ou stockez-les pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Stockez les colonnes utilisées pour une utilisation ultérieure.<ol>
<li>Laver la colonne avec 25 mL d’isopropanol à 20 % et jeter le volume élué. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de PBS.</li>
		<li>Ajoutez la mémoire tampon de stockage supprimée à l’étape 1.1.1 et attendez que la mémoire tampon entre dans la colonne. Couvrir la colonne avec le bouchon et conserver à 4 oC jusqu’à utilisation ultérieure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantification des VE
<ol><li>Préparer les dilutions 1:1 000 de l’échantillon NTA-PL-EV et de l’échantillon PL-EV initial comme décrit dans les deux étapes suivantes.<ol>
<li>Préparer 1 mL de NTA-PL-EV dilué à 1:10 et 1 mL de PL-EV initial dilué à 1:10 avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.</li>
		<li>Préparer 1 mL d’une dilution à 1:100 des échantillons dilués précédents avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter l’échantillon NTA-PL-EV dilué au 1:1 000 ou l’échantillon PL-EV initial à l’aide d’une seringue stérile dans la pompe NTA. Suivez les instructions et les recommandations du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique. REMARQUE: Comme la concentration de VE dépend du volume de démarrage de l’échantillon, il peut être nécessaire de lire les dilutions intermédiaires et de faire des ajustements pour obtenir une détermination correcte de la NTA.</li>
</ol>5. Ve électriques utilisés comme traitement de l’arthrose induite par l’inflammation
<ol><li>Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de 3 mm de diamètre dans des conditions stériles. REMARQUE: Effectuez la procédure des étapes 5.1 à 5.6 dans une culture cellulaire.</li>
	<li>Placer les explantes dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12 complété par 1% de pénicilline-streptomycine à 37 oC, 5% de CO2et 80% d’humidité.<ol>
<li>Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 ng / mL d’oncostatine M et 2 ng / mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traiter les explants avec 1 × 109 particules/puits de VE marqués (PKH-PL-EV) ou contrôler dans un milieu de culture cellulaire complété par de l’oncostatine M et du TNFα. REMARQUE: Mesurer le volume de l’échantillon contenant 1 × 109 particules / puits et utiliser le même volume pour le contrôle.</li>
	<li>Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajouter 200 μL du milieu de culture cellulaire décrit à l’étape 5.3 à chaque puits. REMARQUE: Si les plaques de 96 puits ont été en contact avec du sérum bovin fœtal (FBS), lavez chaque puits trois fois avec 200 μL de PBS pour retirer tout VE du FBS.</li>
	<li>Arrêtez le test in vitro à différents moments: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h.</li>
	<li>Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le tissu pour le fixer pendant 3 h à 4 oC. REMARQUE : Les étapes impliquant des PFA doivent être effectuées dans une hotte aspirante conformément aux recommandations de la fiche de données de sécurité.</li>
	<li>Retirer le PFA, ajouter 100 μL de PBS, conserver le tissu fixe à 4 °C et traiter les échantillons dans les 48 h.</li>
</ol>6. Préparation et visualisation de la microscopie
REMARQUE: Cette procédure histologique consiste en des étapes de déshydratation, d’incorporation de paraffine et de réhydratation. Ces étapes peuvent réduire la fluorescence globale des colorants (une limitation mentionnée dans la fiche technique du PKH26). Par conséquent, d’autres procédures, telles que le sectionnement congelé, peuvent être plus appropriées pour la visualisation EV par microscopie confocale.
<ol><li>Incorporez les tissus fixes dans des blocs de paraffine. Coupez le tissu en sections de 6 μm d’épaisseur.</li>
	<li>Déparaffiniser les sections tissulaires. REMARQUE: Toutes les étapes utilisant du xylène doivent être effectuées dans une hotte.<ol>
<li>Immerger les coupes de tissus dans du xylène pendant 30 min, 100% d’éthanol pendant 2 min, 96% d’éthanol pendant 2 min, 75% d’éthanol pendant 1 min, et enfin dans de l’eau distillée pendant 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perméabiliser les coupes tissulaires.<ol>
<li>Préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % de Triton-0,1 % pour perméabiliser le tissu. Ajouter une goutte de 20 μL à chaque section de tissu et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lavez chaque section deux fois avec 20 μL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sur une lame microscopique, ajouter une goutte de milieu de montage contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec un milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence. Couvrez la lame contenant 3 coupes de tissu de l’étape 6.3.1.</li>
	<li>Incuber les toboggans pendant la nuit à température ambiante, à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à la microscopie confocale.</li>
</ol>

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<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’imagerie des VE aide à comprendre les propriétés des VE, telles que leurs mécanismes de libération et d’absorption. Leur imagerie permet le suivi de leur biodistribution et la caractérisation de leurs propriétés pharmacocinétiques en tant que véhicules médicamenteux. Cependant, l’imagerie et le suivi des VE peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, bien que de nombreux dispositifs d’imagerie et techniques d’étiquetage aient été développés pour aider les chercheurs à surveiller les VE dans des conditions ...

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire1. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précocesde l’arthrose 4. Les thérapies cellulaires sont limitées principalement en raison du nombre limité de chondrocytes phénotypiquement stables ou de chondroprogenitors capables de réparer efficacement le cartilage3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir la progression de la maladie et régénérer les grandes lésions cartilagineuses est d’une importance capitale.
Les vésicules extracellulaires (VE) ont été suggérées comme traitement de l’arthrose par différents auteurs5,6. Les VE sont des corps membraneux sécrétés par la majorité des types de cellules, sont impliqués dans la signalisation intercellulaire et il a été démontré qu’ils exercent les effets thérapeutiques des cellules souches7,8,9, en raison desquels ils ont récemment suscité un intérêt pour la médecine régénérative10. Les VE dérivés de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont les principaux VE thérapeutiques étudiés pour l’arthrose, bien que d’autres cellules liées aux articulations aient été utilisées comme sources de VE, par exemple, les chondroprogeniteurs ou les cellules immunitaires11,12.
Les concentrés de plaquettes, tels que les lysats plaquettaires (PL), sont utilisés pour améliorer la cicatrisation des plaies dans différentes blessures, telles que les ulcères cornéens13,14,15 ou dans la régénération du tissu tendineux16, en raison de l’hypothèse que le composant EV des concentrés plaquettaires peut être responsable de ces effets17 . Certaines études liées aux maladies articulaires utilisent des VE d’origine plaquettaire (PL-VE) comme traitement pour améliorer les conditions arthrosiques. Les PL-EV améliorent la prolifération des chondrocytes et la migration cellulaire en activant la voie Wnt/β-caténine18,favorisant l’expression de marqueurs chondrogènes dans les chondrocytes arthrosiques19,ou montrant des niveaux plus élevés de protéines chondrogènes et moins d’anomalies tissulaires chez les lapins arthrosiques traités par PL-VE18.
Les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques qui sont libérés dans la cellule cible, établissant une communication de cellule à cellule, qui est la principale caractéristique liée à leurs applications thérapeutiques20. Les effets des véhicules électriques dépendent de leurs cellules d’atteinte et du rejet ultérieur de la cargaison. Cet effet peut être confirmé indirectement par des changements causés dans les cellules, tels que l’activité métabolique ou la modification de l’expression des gènes. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de visualiser comment les VE atteignent les cellules pour exercer leur fonction. Ainsi, cet article présente une méthode pour étiqueter ces VE dérivés de PL à utiliser comme traitement pour les explants de cartilage OA induits par l’inflammation. La microscopie confocale a été utilisée pour surveiller l’absorption et la progression de la VE vers les chondrocytes présents dans les explants en un laps de temps de 5 h.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Tube à centrifuger</td><td>SPL life sciences</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringue BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Préparé à 20 % avec de l’eau Milli-Q</td></tr><tr><td>Plaque de culture à 96 puits</td><td>SPL life sciences</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Éthanol absolu Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Utilisé pour préparer de l’éthanol à 96 % et 75 % avec de l’eau Milli-Q</td></tr><tr><td>Biopsie Punch avec piston 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin&nbsp ; Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Préparé à 5 % avec</td></tr><tr><td>des explants de cartilage</td> PBS <td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de concentration 15 mL Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Tube de concentration 500 &micro ; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Blocs de tissu de paraffine intégrés</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td>Rémunération à l’acte</td></tr><tr><td>Colonnes mini-HD exo-spin</td><td>Systèmes de guidage cellulaire</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &micro ; m filtre à seringue</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield avec DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Préparer une solution mère à une concentration finale de 0,1 & micro ; g/&micro ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Préparé à 4 % avec PBS et stocké à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de liaison cellulaire fluorescente rouge pour le marquage général de la membrane cellulaire</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 et Dliuent C inclus</td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNFet alpha ;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA-005</td><td>Préparer une solution mère à une concentration finale de 0,01 & micro ; g/&micro ; L dilué dans PBS-0,1 % BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Utilisé pour préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % Triton-0,1 % avec de l’eau Milli-Q</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11</td></tr><tr><td>rotor NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td>Dispositif avec laser intégré à &lambda ;= 532 nm et caméra sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Microtome manuel</td><td>Thermo Scientific&trade ;</td><td></td><td></td>A78100101</tr><tr><td>Microscope confocal TCS-SPE</td><td>Leica Microsystems</td><td>5200000271</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Les vésicules extracellulaires (VE) sont utilisées dans différentes études pour prouver leur potentiel en tant que traitement sans cellules en raison de leur cargaison dérivée de leur source cellulaire, comme le lysat plaquettaire (PL). Lorsqu’ils sont utilisés comme traitement, on s’attend à ce que les VE pénètrent dans les cellules cibles et y répondent. Dans cette recherche, les VE dérivés de PL ont été étudiés comme traitement sans cellules pour l’arthrose (OA). Ainsi, une méthode a été mise en place pour étiqueter les VE et tester leur absorption sur les explants cartilagineux. Les VE dérivés de PL sont marqués avec le colorant lipophile PKH26, lavés deux fois à travers une colonne, puis testés dans un modèle d’arthrose in vitro induit par l’inflammation pendant 5 h après quantification des particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Toutes les heures, les explants de cartilage sont fixés, paraffinés, coupés en sections de 6 μm pour être montés sur des lames et observés au microscope confocal. Cela permet de vérifier si les VE pénètrent dans les cellules cibles (chondrocytes) pendant cette période et d’analyser leur effet direct.

Une vue d’ensemble schématique de l’étiquetage des véhicules électriques et de la surveillance de l’absorption est illustrée à la figure 1. La concentration de particules et la taille des VE détectées par la NTA dans le tableau 1 montrent que la concentration de VE diminue au cours du processus en raison de l’étape de purification effectuée deux fois après l’étiquetage avec la colonne. Cependant, la quantité obtenue se situe dans la plage optimale du nombre de particules à u...

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Ce protocole simple permet d’étiqueter les VE et de les surveiller par microscopie confocale. Par exemple, l’imagerie des VE pourrait aider à évaluer la distribution des VE lorsqu’elle est utilisée dans des thérapies. Cette technique permet de surveiller facilement la migration et l’absorption des VE dans les explants cartilagineux, avec la microscopie confocale sans fonction particulière.Le même protocole peut être utilisé pour les VE pour des expériences in vitro ou in vivo. Assurez-vous que les colonnes sont préparées à l’avance et que le volume initial des véhicules électriques est suffisant pour atteindre la concentration finale de particules souhaitée, étant donné qu’environ 10% des particules seront perdues lors de l’étape de purification. Commencez par concentrer l’échantillon de vésicule extracellulaire, ou EV, et le témoin.Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 millilitres ou 500 microlitres, selon le volume de départ de l’échantillon EV. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec. Remettez en suspension les échantillons EV concentrés avec 200 microlitres et le groupe témoin avec 100 microlitres de diluant C, et transférez-les dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 millilitre.Séparez l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 microlitres chacune. Marquez l’une des aliquotes avec du colorant et utilisez-la comme traitement. Laissez l’autre non marqué, mais traitez-le comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par analyse de suivi des nanoparticules.Préparer 2x solution de colorant de telle sorte que la concentration résultante de la solution de PKH26 dans le diluant C soit de huit micromolaires. Mélanger un microlitre d’un millimolaire PKH26 par 125 microlitres de diluant C dans l’échantillon. Préparez le volume requis pour ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.Ajouter 2x solution de colorant aux VE dérivés du lysat plaquettaire PKH et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1, pour obtenir une concentration de colorant de 1x et quatre concentrations de PKH26 micromolaires. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon de VE dérivé du lysat plaquettaire NTA. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter 5% de solution d’albumine-PBS sérique bovine aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 microlitres. Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions de colorant non spécifique avec la colonne. Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 microlitres de VE dérivés du lysat plaquettaire PKH, de VE dérivés du lysat plaquettaire NTA, ou contrôlez et jetez tout liquide élué.Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 microlitres de PBS et jeter tout le liquide élué. Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.Ajouter 600 microlitres de PBS et recueillir une fraction de 600 microlitres dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour une nouvelle colonne, répétez les étapes impliquant la concentration des échantillons mentionnés au début du protocole. Ajoutez 600 microlitres de véhicules électriques précédemment élués à la colonne et jetez le volume élué.Ajoutez ensuite 400 microlitres de PBS et jetez tous les volumes élués. Ajoutez 600 microlitres de PBS à la colonne et collectez une fraction de 600 microlitres dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre. Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de trois millimètres de diamètre dans des conditions stériles.Placez les explants dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12, complété par 1% de streptomycine de pénicilline à 37 degrés Celsius, 5% de CO2 et 80% d’humidité. Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 nanogrammes par millilitre d’oncostatine M et deux nanogrammes par millilitre de facteur de nécrose tumorale-alpha. Traiter les explants avec 1 fois 10 à 9ème particules par puits de VE dérivés du lysat plaquettaire PKH, ou de contrôle, dans un milieu de culture cellulaire complété par l’oncostatine M et le facteur de nécrose tumorale-alpha.Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajoutez 200 microlitres du milieu de culture cellulaire à chaque puits comme décrit dans le manuscrit. Arrêtez le test in vitro toutes les heures de zéro à cinq heures.Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 microlitres de PBS. Ajouter 100 microlitres de 4% de paraformaldéhyde au tissu pour le fixer pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Retirez le PFA, ajoutez 100 microlitres de PBS, stockez le tissu fixe à quatre degrés Celsius et traitez les échantillons dans les 48 heures.Les images prises à différents moments montrent comment les VE pénètrent dans le tissu jusqu’à ce qu’ils atteignent les chondrocytes et pénètrent dans les chondrocytes au fil du temps. Les VE marqués étaient déjà localisés autour des chondrocytes après une heure d’incubation. Assurez-vous que le volume initial des véhicules électriques est suffisant pour atteindre la concentration finale de particules souhaitée.Une autre chose importante à retenir est d’utiliser les véhicules électriques étiquetés dans les prochaines 24 heures. Si vous ne l’utilisez pas dans les 24 heures, une diminution de la fluorescence peut se produire. Cette technique aidera les chercheurs à améliorer l’imagerie des VE et à étudier les VE en biologie et en thérapeutique.

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Objectif de la présentation est de montrer une méthode hautement reproductible pour générer la matrice associée implants de cellules souches dans les lésions du cartilage, qui peuvent être visualisées avec l'IRM. Les cellules souches sont étiquetés avec approuvée par la FDA Ferumoxides, mélangés avec l'agarose, implantés dans les lésions du cartilage et imagé avec un scanner IRM 7T.

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test permettant de visualiser et de quantifier l’absorption cellulaire de vésicules extracellulaires ou VE. Ce test utilise l’imagerie fluorescente 3D à l’aide d’un microscope confocal et permet de distinguer les VE internalisés de ceux collés à la surface de la cellule.

Dosage de l’absorption des vésicules extracellulaires : méthode de visualisation et de quantification de l’absorption cellulaire des vésicules extracellulaires à l’aide d’une technique d’imagerie par fluorescence 3D

Ce protocole décrit un moyen efficace de contrôler la persistance de la cellule et la biodistribution des dérivés adipeux mésenchymateuses des cellules souches humaines (haMSCs) par fluorescence rouge sombre étiquetage dans un modèle de l’arthrose (KOA) de genou de rat par injection intra-articulaire de (IA).

In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

Dans ce protocole, nous décrivons le flux de travail complet pour isolation rapide des vésicules extracellulaires du sang humain et de la caractérisation des marqueurs spécifiques par analyse de suivi des nanoparticules axée sur la fluorescence. Les résultats présentés montrent une reproductibilité élevée et peuvent être ajustées pour les surnageants de culture cellulaire.

Caractérisation de basés sur la Fluorescence rapide unique vésicules extracellulaire dans le sang humain avec analyse de suivi des nanoparticules

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Nous décrivons un protocole pour étiqueter les petites vésicules extracellulaires dérivées de macrophages avec des colorants PKH et observons leur absorption in vitro et dans la moelle épinière après l’administration intrathécale.

Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière

Les vésicules extracellulaires (VE) contribuent à la biologie cellulaire et aux communications intercellulaires. Il est nécessaire de réaliser des tests pratiques pour visualiser et quantifier l’absorption des VE par les cellules. Le protocole actuel propose le test d’absorption ev en utilisant l’imagerie de fluorescence tridimensionnelle par microscopie confocale, après l’isolement EV par un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration.

Test d’absorption des vésicules extracellulaires par analyse d’imagerie au microscope confocal

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Le présent protocole décrit la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs (exosomes et microvésicules) provenant de CSM humaines en culture. D’autres applications de ces véhicules électriques sont également expliquées dans cet article.

Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture

Ce protocole fournit une description détaillée du tri des vésicules extracellulaires (VE) libérées par les cellules stromales mésenchymateuses. Il se concentre en particulier sur le réglage de l’instrument et l’optimisation des conditions de tri. L’objectif est de trier les vésicules extracellulaires tout en préservant leurs caractéristiques.

Mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires

Apprenez à marquer les vésicules extracellulaires pour surveiller leur migration et absorption dans les explants cartilagineux par microscopie confocale. Cette méthode facilite l'étude des mécanismes de l'ostéoarthrite.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

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