Fonctionnalisation des vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes des implants Ti
5 août 2021
Nous présentons ici une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées des lysats plaquettaires (PL) et leur utilisation pour le revêtement des surfaces implantaires en titane (Ti). Nous décrivons la méthode de revêtement par coulée goutte, le profil de libération des VE des surfaces et la biocompatibilité in vitro des surfaces Ti revêtues de VE.
La combinaison de vésicules extracellulaires avec des biomatériaux est une approche souhaitable pour les études de médecine régénérative. Ainsi, cette étude rapporte la fonctionnalisation du titane avec les VE comme un outil pratique pour l’orthopédie et la régénération osseuse. La fonctionnalisation par coulée goutte est une méthode facile et peu coûteuse par rapport à d’autres stratégies telles que le piégeage polymère ou la liaison biochimique.
Commencez la fonctionnalisation de la surface en titane en lavant les disques de titane avec de l’eau désionisée dans un bécher en verre. Ensuite, jetez l’eau avant de laver les disques avec de l’éthanol à 70%. Décantez la solution pour soniquer les implants lavés à 50 ° C pendant cinq minutes dans de l’eau désionisée.
Après avoir jeté l’eau, incubez les implants en titane dans une solution d’hydroxyde de sodium à 40% à 50 ° C pendant 10 minutes avec agitation, puis soniquez les implants dans de l’eau désionisée comme démontré. Ensuite, effectuez au moins cinq lavages des implants avec de l’eau désionisée. Jusqu’à ce que le pH soit neutre sur l’indicateur de pH.
Répétez le processus de sonication et d’incubation, comme expliqué précédemment, en remplaçant l’hydroxyde de sodium par de l’acide nitrique à 50%. Effectuez les lavages et la sonication avec de l’eau désionisée avant de stocker les implants dans une solution à 70% d’éthanol. Incuber les implants en titane dans une solution d’acide nitrique à 30% pendant 30 minutes à température ambiante avec une légère agitation.
Après l’incubation, effectuez au moins cinq lavages à l’eau désionisée jusqu’à ce que le pH soit neutre sur les indicateurs de pH. Ensuite, incubez des implants en titane pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau désionisée. Le lendemain, séchez les implants sous vide à 40 °C pendant 10 minutes.
En travaillant sous l’armoire de culture cellulaire, placez les implants en titane dans une plaque de 96 puits avec le côté machine tourné vers le haut. Organisez la coulée des vésicules extracellulaires par décongélation de la solution des VE et la solution vortexing à une impulsion de trois secondes. Après mélange, déposez 40 microlitres de la solution de VE sur la surface du titane pour immobiliser un maximum de 4 x 10^11 VE par implant, selon la concentration déterminée par analyse de suivi des nanoparticules.
Ensuite, placez les plaques sous vide à 37 ° C pendant environ deux heures ou jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches. Ajustez le temps de séchage en fonction du nombre d’implants en titane et de l’eau présente dans la chambre à vide. La quantité de véhicules électriques libérés par les disques de titane a été mesurée par analyse de suivi des nanoparticules.
Le jour 2, environ 10 ^ 9 véhicules électriques ont été libérés, suivis d’une libération prolongée les jours 6, 10 et 14. La biocompatibilité cellulaire in vitro des VE en titane a été évaluée à l’aide d’un test de libération de lactate déshydrogénase, ou LDH, 48 heures après l’ensemencement des cellules sur les implants. Les VE en titane présentaient une quantité de LDH inférieure à la valeur cytotoxique maximale acceptée.
Alors que le groupe témoin du titane présentait des niveaux d’activité LDH plus élevés. L’étape la plus importante est le séchage sous vide de l’implant revêtu. Il est important de s’assurer que toute l’eau est évaporée pour obtenir une physisorption optimale.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode d'isolement des vésicules extracellulaires (VE) à partir de lysats plaquettaires et leur application dans le revêtement de surfaces d'implants en titane. L'accent est mis sur la méthode de dépôt par goutte pour la fonctionnalisation, le profil de libération des VE et la biocompatibilité des surfaces revêtues.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Médecine régénérative
- Orthopédie
- Biomatériaux
Contexte
- Les vésicules extracellulaires jouent un rôle important en médecine régénérative.
- Le revêtement de biomatériaux par des VEC peut améliorer leurs fonctions.
- Le titane est couramment utilisé dans les implants orthopédiques.
- Les méthodes de fonctionnalisation varient selon leur complexité et leur coût.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pratique pour la fonctionnalisation de surfaces en titane.
- Évaluer la biocompatibilité des surfaces en titane recouvertes d'EV.
- Proposer une alternative rentable aux techniques de fonctionnalisation existantes.
Méthodes utilisées
- Isolation des VES à partir de lysats plaquettaires.
- Méthode de dépôt par goutte pour le revêtement de surfaces en titane.
- Lavage des disques de titane avec de l'eau déionisée et de l'éthanol.
- Sonication des implants pour améliorer la préparation de surface.
Résultats principaux
- Isolation réussie des VES à partir de lysats plaquettaires.
- Revêtement efficace de surfaces en titane par la méthode de dépôt par goutte.
- Profil de libération des VES à partir des surfaces revêtues démontré.
- La biocompatibilité in vitro des surfaces en titane revêtues de VES a été confirmée.
Conclusions
- La méthode de dépôt par goutte est une approche viable pour la fonctionnalisation du titane.
- Les surfaces de titane revêtues d'EV présentent un potentiel pour des applications orthopédiques.
- Cette méthode offre une alternative peu coûteuse pour la fonctionnalisation de biomatériaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une fonctionnalisation peu coûteuse et évolutive d'implants en titane à l'aide de vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes afin d'améliorer le potentiel ostéogénique dans les applications orthopédiques. En améliorant la bioactivité des biomatériaux grâce à la signalisation médiée par les vésicules extracellulaires, elle soutient la validation précoce des cibles dans les stratégies de régénération osseuse. L'approche offre une plateforme reproductible pour réduire les risques liés au développement préclinique de thérapies régénératives basées sur des implants.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies de signalisation ostéogénique médiées par les vésicules extracellulaires sur des surfaces biomatériaux.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode normalisée et peu coûteuse pour préparer des surfaces d'implants bioactives destinées au criblage fonctionnel.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des profils quantifiables de libération d'EV mesurables par analyse de suivi de nanoparticules, permettant la standardisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet un revêtement de surface reproductible par dépôt en goutte, facilitant une évaluation cohérente de composés ou de biomatériaux in vitro.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre une libération prolongée de VEs sur 14 jours, soutenant un signal bioactif prolongé dans les modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Confirme la biocompatibilité par le test de LDH, réduisant le risque de cytotoxicité lors de l'évaluation précoce des implants.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en permettant la préparation de surfaces pour le criblage bioactif, le développement de tests et la validation d'implants dans les procédés de régénération osseuse.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les mécanismes ostéogéniques induits par les VES sur des substrats en titane.
- Évaluation : Permet un revêtement standardisé et reproductible des implants pour une analyse cohérente de composés bioactifs ou de vésicules.
- Analytique : Fournit des données quantitatives sur la libération des VES par suivi de nanoparticules et des indicateurs de biocompatibilité par test de LDH.
- Recherche translationnelle : Relie la fonctionnalisation des VES au stade de découverte à la validation préclinique grâce à des données sur la libération prolongée et la biocompatibilité.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme réutilisable et peu coûteuse pour la fonctionnalisation d'implants à base de titane dans divers programmes de médecine régénérative.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en validant l'activité ostéo-inductive médiée par les vésicules extracellulaires sur les surfaces des implants.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des étapes standardisées de lavage, de sonication et de séchage sous vide.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques en phase avancée en permettant une évaluation précoce de la biocompatibilité et de la bioactivité des implants.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'orientation avec ou sans poursuite, ajustées au risque, dans les filières de développement de biomatériaux orthopédiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans l'isolement des vésicules extracellulaires et l'analyse de suivi de nanoparticules.
- Dépend de l'accès à un équipement de séchage sous vide et à un suivi du pH pour la préparation des surfaces.
- Nécessite une standardisation de la concentration des vésicules extracellulaires et du volume des gouttes entre les différents lots de production.
- Implique des adaptations à prévoir selon les géométries et les surfaces des implants en titane.
- Limité par la nécessité d'une manipulation aseptique lors des étapes de dépôt et de séchage des vésicules extracellulaires.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Titanium Discs Wash
1:43
Titinium Passivation and Extracellular Vesicles (EVs) Drop Casting
3:04
Results: Accumulative EV Release of Titanium Functionalized Surfaces and In Vitro Cell Biocompatibility of Titanium-EVs
3:50
Conclusion
