Name: Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Apprenez la transduction transitoire rapide d'Echinococcus granulosus à l'aide de vecteurs lentiviraux de troisième génération. Cette méthode permet d'étudier la pathogenèse de l'échinococcose kystique et de surmonter les limitations des systèmes d'évaluation génique existants.

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La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par Elite Researcher Grant Committee sous le numéro de bourse 958680 de l’Institut national pour le développement de la recherche médicale (NIMAD), Téhéran, Iran.

Cette étude a été approuvée par le National Institute for Medical Research Development et le Research Ethics Review Committee, No. 958680. Les lentivirus sont classés comme organismes BSL-2; par conséquent, toutes les procédures de culture en laboratoire de ce protocole ont été effectuées à l’aide de pratiques de laboratoire stériles et menées sous une hotte à écoulement laminaire conformément aux directives des NIH. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les différents stades d’E. granulosus .
1. Collecte des kystes hydatiques
<ol><li>Recueillir les kystes hydatiques hépatiques de moutons naturellement infectés régulièrement abattus dans un abattoir.</li>
	<li>Stériliser complètement la surface du kyste à l’aide de gaze stérile et d’alcool à 70% avant d’aspirer les protoscolacées (PSC).</li>
	<li>Aspirer 20 à 50 mL de liquide hydaside dans des tubes coniques stériles de 50 mL.</li>
	<li>Après le drainage, épongez le kyste avec une lame tranchante, transférez la couche germinale dans un tube conique stérile de 50 mL et secouez-le pendant une courte période (~ 2 min) pour augmenter la collecte de CSP. Transférez la couche germinale dans un nouveau tube de 1,5 mL pour la caractérisation moléculaire.</li>
	<li>Lavez les CSP 3-5x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Observez les CSP dans 0,1 % d’éosine pendant 5 min pour déterminer la viabilité du CSP au microscope optique. Utilisez des CSP dont la viabilité pour la culture est d’au moins 95 %.</li>
	<li>Traiter le précipité de CSP avec 2 mL de pepsine (2 mg/mL, pH 2) pendant 15-20 min.</li>
	<li>Pour isoler les CSP individuels, remettez en suspension les sédiments de CSP dans le PBS et passez-les à travers deux couches de gaze stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. REMARQUE : Calculer la moyenne de trois dénombrements sur 50 μL de sédiments PSC à l’aide d’un microscope optique. Pour les essais ultérieurs, utilisez la valeur estimée pour déterminer les CSP/μL. Chaque isolat de kyste hydatide doit être caractérisé sur la base de polymorphismes nucléotidiques par des méthodes moléculaires, telles que le séquençage par PCR17 ou l’analyse de la courbe de fusion à haute résolution18.</li>
</ol>2. Culture biphasique de CSP d’E . granulosus pour obtenir des vers adultes
REMARQUE : Les CSP isolés doivent être cultivés dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire de classe II. Préparer séparément les phases solide et liquide du milieu de culture biphasique avant de passer aux étapes suivantes19.
<ol><li>Préparer le milieu de culture biphasique à se composer de deux phases.<ol>
<li>
Pour la phase solide, ajouter 10 mL de sérum bovin dans une fiole de 25 mL et laisser coaguler à 76 °C pendant 20-30 min.</li>
		<li>
Pour la phase liquide (CMRL modifié), mélanger 100 mL de sérum de veau fœtal (FCS) inactivé par la chaleur, 36 mL d’extrait de levure à 5 %, 5,6 mL de glucose à 30 % (dans de l’eau distillée), 1,4 mL de bile de chien à 5 % dans le PBS, 20 mM de tampon HEPES et 10 mM de NaHCO3 dans 260 mL de milieu CMRL-1066. Enfin, ajouter la pénicilline (100 UI/mL) et la streptomycine (100 mg/mL) au mélange.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 10 mL du milieu de phase liquide à chaque fiole de culturede 25 cm 2 .</li>
	<li>Ajouter environ 5 000 CSP à la fiole de culture et transférer la fiole dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).</li>
	<li>Après 24-48 h, transférer les CSP dans une nouvelle fiole avec la phase solide (sérum bovin) et ajouter 1 mL du même milieu liquide frais par fiole. Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2).</li>
	<li>Tous les 5 à 7 jours, remplacez le milieu par un milieu liquide frais en fonction des changements de couleur du milieu de culture et de la proportion estimée de CSP différenciés. REMARQUE: Les protoscoléces réagissent rapidement aux changements environnementaux après avoir été cultivées, et la plupart d’entre elles subissent une différenciation dans les 2-3 semaines. En raison de la consommation de nutriments et de la croissance et du développement des protoscolèces, le pH du milieu de culture change et sa couleur se déplace vers l’orange et le jaune.</li>
</ol>3. Culture monophasique de CSP d’E. granulosus
<ol><li>Assurez-vous que la culture monophasique est faite 24-48 h avant la transduction.<ol>
<li>Culture ~5 000 CSP dans une fiole de culture de 25 cm2 avec RPMI et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).</li>
		<li>Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 (37 °C, 5 % de CO2) jusqu’à utilisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Culture cellulaire pour la production et la préparation de virus
REMARQUE: Des cellules 293T (HEK293T) embryonnaires humaines ont été obtenues pour la production de vecteurs au centre de recherche sur la pathologie et les cellules souches de l’Université des sciences médicales de Kerman.
<ol><li>Transférer 5 × 10 cellules HEK293T dans une fiole de 25 cm2 contenant 5 mL de DMEM avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.</li>
	<li>Incuber les cellules HEK293T à 37 °C dans 5 % de CO2 et les passer dans le milieu de culture complet toutes les 48 h. Enfin, utilisez des cellules HEK293T à faible passage pour la transduction20.</li>
</ol>5. Production et préparation du virus avec les vecteurs lentiviraux de troisième génération
REMARQUE: Le vecteur lentivirus pCDH513b (vecteur de transfert) et PLPII, PLPI et PMD2G (vecteurs auxiliaires) ont été utilisés pour exprimer le gène rapporteur GFP. Voir le tableau des matériaux et la figure supplémentaire S1.
<ol><li>Jour 1 :<ol>
<li>Après avoir trypsinisé les cellules HEK293T21 dans des plaques de culture à 6 puits, ensemencez 7 × 104 cellules par puits avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 10% de FBS.
</li>
		<li>Utilisez des cellules à une confluence de 50% à 60% pour la transduction par la méthode du phosphate de calcium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 2:<ol>
<li>Remplacez le milieu de culture cellulaire 2-3 h avant l’expérience avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 2% de FBS.</li>
		<li>Dans un tube de 1,5 mL, mélanger les plasmides lentiviraux de troisième génération, y compris 7 μg/μL pCDH513b (vecteur de transfert), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI et 2 μg/μL PMD2G (vecteurs auxiliaires).</li>
		<li>Ajouter le tampon HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES et 1,5 mM Na2HPO4; plage de pH optimale, 7,00-7,28) au mélange à un volume de 422 μL.</li>
		<li>Ajouter 16 μL de tampon Tris-EDTA (TE) à 1 % au mélange.</li>
		<li>Ajouter 62 μL de chlorure de calcium de 2,5 mM aux tubes et bien mélanger.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de 2x solution saline tamponnée HEPES (HBS) au mélange, goutte à goutte, dans les 1-2 minutes à l’aide d’une pipette Pasteur. Mélanger doucement jusqu’à l’obtention d’une solution semi-opaque et incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents.</li>
		<li>Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et remplacer le milieu après 4-6 h par du DMEM sans antibiotique contenant 10 % de FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3:<ol>
<li>Confirmer la transduction transitoire réussie et la viabilité cellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 4:<ol>
<li>Récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et conservez-les à -70 °C jusqu’à leur utilisation. REMARQUE: Les lentivirus récoltés pourraient être concentrés et titrés pour une transfection précise22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Transduction transitoire de différents stades d’E. granulosus avec le virus
<ol><li>Jour 1 :<ol>
<li>Utilisez une plaque de culture à 12 puits pour le transfert de gènes. Culture 5 × 103-5 × 104 cellules HEK293T en triple, avec un milieu DMEM complet comme référence interne.</li>
		<li>Culture 150 PSC frais en triple exemplaire en RPMI et 10% FBS.</li>
		<li>Culture 30 vers strobilés en triple exemplaire dans du DMEM contenant 10% de FBS inactivés par la chaleur. REMARQUE: Tous les milieux de transduction doivent être sans antibiotiques. Conservez trois puits témoins non traités pour les cellules HEK293T, les CSP et les vers strobilés dans le processus.</li>
		<li>Préparer un mélange de 1 × 106 virus avec un réactif de transfection de 4 μg/mL (voir la Table des matériaux) pour transduire les cellules HEK293T et les différents stades du ver.</li>
		<li>Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents. Incuber les plaques pendant 4-6 h dans un incubateur à CO2 (37 °C, 5% co2). Remplacer le milieu de chaque échantillon par le même milieu de culture complet afin de minimiser les effets toxiques du réactif de transfection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 2:<ol>
<li>Répétez les étapes 6.1.4 à 6.1.5 pour augmenter l’efficacité de la transduction transitoire pour les cellules HEK293T, les PSC et les vers strobilés.</li>
		<li>Incuber toutes les plaques pendant 24-48 h dans un incubateur à CO2 avec les mêmes conditions de culture en fonction du type de milieu cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jour 3:<ol>
<li>Vérifiez si la transduction réussit en utilisant la microscopie à fluorescence. REMARQUE: Envisagez d’utiliser d’autres tests de confirmation comme la PCR / qPCR20,23 ou les techniques de transfert Western24 dans la procédure de transfert de gènes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Borhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcoses+in+Iran%2C+Turkey%2C+and+Pakistan%3A+Old+diseases+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium.</a> Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).</li>
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<li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).</li>
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<li>Koziol, U., Brehm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Echinococcus+genomics+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research.</a> Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Comprendre la base moléculaire des nématodes et la biologie de Platyhelminthes est crucial pour comprendre la pathogénicité des parasites zoonotiques27. L’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes est un obstacle majeur à l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus 12,27. La présente étude démontre l’excellent potentiel du lentivirus dans la transdu...

L’échinococcose kystique (EC) est l’une des plus importantes maladies helminthes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia de la famille des Taeniidae 1,2. Des études approfondies sur le développement d’immunodiagnostics et de vaccins contre E. granulosus ont été réalisées. Cependant, une connaissance insuffisante de la base moléculaire de la biologie parasitaire pose des limites majeures dans le diagnostic, la gestion et la prévention de la maladie hydatide 3,4,5,6.
Au cours des dernières années, en raison du développement du séquençage du génome et des méthodes transcriptomiques, un large éventail d’études moléculaires ont été menées sur les vers plats par plusieurs groupes de recherche 7,8,9. Cependant, dans le monde des parasites, les progrès de la technologie de transfert de gènes chez les vers plats parasites sont encore limités par rapport aux méthodes de transduction transitoire hautement reproductibles développées pour certains protozoaires 10,11,12.
L’utilisation de systèmes d’administration virale est devenue un outil essentiel pour l’administration de transgènes et les études de gènes et de protéines au cours des deux dernières décennies13. Le lentivirus infecte à la fois les cellules en division et les cellules non divisées, ce qui permet d’infecter les cellules postmitotiques 14,15,16. Des preuves récentes indiquent que l’utilisation d’un système de transduction à base de lentivirus dans les cellules de mammifères offre le potentiel de surmonter la plupart des limites des techniques précédentes d’entrée et de renversement. La conception et la construction de vecteurs lentiviraux d’expression avec des marqueurs moléculaires appropriés, tels que l’expression GFP, ont été décrites précédemment16. Par conséquent, nous évaluons la transduction transitoire lentivirale d’un gène rapporteur GFP chez les protoscolèces et les vers strobilés d’E. granulosus.

<table><tbody><tr><td>Plaques de culture 12 puits</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Flacon de culture</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 6 puits</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>Concentration de travail : 2,5 mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 moyen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur</td><td>memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Bile de</td><td></td><td></td> chien <td>Isolé d’un chien euthanasié et stérilisé par 0,2 &mu ; Filtre à seringue</td></tr><tr><td>m Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td>préparer 0,1 % d’Eosin pour le test d’exclusion de travail</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>Inactivation thermique&nbsp ; de&nbsp ; FBS (30 min à 40 &deg ; C)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>Inactivation thermique&nbsp ; de&nbsp ; FCS (30 min à 40 &deg ; C)</td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>Rein embryonnaire humain 293T</td></tr><tr><td>HEPES solution saline tamponnée (HBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x concentré</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU</td><td>Concentration de travail : 100 UI/mL</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Roche</td><td>10108057001</td><td>Concentration de travail : 2 mg/mL, pH 2</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td><td>Ce réactif se résout en moins de 1 min dans D.W</td></tr><tr><td>Polybrene (réactif de transfection)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>Concentration de travail : 100 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Plasmide lentiviral de troisième génération (pCDH513b)</td><td>SBI System Biosciences (BioCat GmbH)</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>Vecteur de transfert (obtenu commercialement du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Plasmide lentiviral de troisième génération (pLPI et pLPII)</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>K4975-00</td><td>Vecteur auxiliaire (obtenu commercialement auprès du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Plasmide lentiviral de troisième génération (pMD2G)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12259</td><td>Vecteur auxiliaire (obtenu commercialement du Département de recherche en médecine moléculaire du Centre universitaire iranien pour l’éducation, la culture et la recherche (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Tampon Tris/EDTA (TE)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x solutions de travail (pH 7.4&ndash ; 7.6)</td></tr></tbody></table>

transduction transitoire des formes strobilées d’echinococcus granulosus

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

L’échinococcose kystique ou maladie hydatide est l’une des maladies parasitaires zoonotiques les plus importantes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia hébergé dans l’intestin des chiens. Il est urgent de mener des recherches en génétique appliquée pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse et du contrôle et de la prévention des maladies. Cependant, l’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes entrave l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris l’espèce Echinococcus . La présente étude démontre le potentiel de transduction transitoire du gène lentiviral dans les formes métacestode et strobilée d’E. granulosus. Les protoscoléces (CSP) ont été isolées à partir de kystes hydatides et transférées dans des milieux de culture biphasiques spécifiques pour se développer en vers strobilés. Les vers ont été transfectés avec le lentivirus de troisième génération récolté, ainsi que des cellules HEK293T comme contrôle du processus de transduction. Une fluorescence prononcée a été détectée chez les vers strobilés sur 24 h et 48 h, indiquant une transduction lentivirale transitoire chez E. granulosus. Ce travail présente la première tentative de transduction transitoire à base de lentivirus chez les ténias et démontre les résultats prometteurs avec des implications potentielles dans des études expérimentales sur la biologie des vers plats.

Nous décrivons ici une technique de transduction transitoire rapide et efficace chez E. granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. Nous avons cultivé des CSP dans un milieu de culture biphasique pour obtenir des vers strobilés, comme décrit précédemment25,26. Les protoscolèces se développent en vers strobilés après 6 semaines in vitro. Différents stades d’E. granulosus ont été observés dans le milieu de cu...

Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération.

Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Transaction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus. Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. L’échinococcose kystique ou maladie hydatide est l’une des maladies parasitaires zoonotiques les plus importantes causées par Echinococcus granulosus, un petit ténia hébergé dans l’intestin des chiens.Il est urgent de mener des recherches en génétique appliquée pour comprendre les mécanismes de pathogenèse et de contrôle et de prévention des maladies. Cependant, l’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes entrave l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus. Les progrès dans le transfert de gènes chez les vers plats parasites sont encore limités par rapport au parasite protozoaire.L’utilisation du système d’administration virale est devenue un outil essentiel pour l’administration de transgènes et l’étude des gènes et des protéines au cours des deux dernières décennies. Nous avons donc évalué la transduction transitoire lentivirale du gène rapporteur GFP aux protoscolèces et aux vers strobilés d’Echinococcus granulosus. La figure 1 illustre une présentation schématique du protocole d’étude pour les stades d’Echinococcus granulosus.Premièrement, la collecte de kystes hydatiques. Recueillir les kystes hydatiques hépatiques de moutons naturellement infectés régulièrement abattus dans un abattoir. Stérilisez complètement la surface du kyste à l’aide de gaze stérile et de 70% d’alcool avant d’aspirer les protoscolacées.Aspirer 20 à 50 mL de liquide hydatide dans des tubes coniques stériles de 50 mL. Après le drainage, épongez le kyste avec une lame tranchante, transférez la couche germinale dans un tube conique stérile de 50 mL et secouez-le pendant une courte période pour augmenter la collecte de protoscolèces. Lavez les protoscolèces avec un tampon PBS trois à cinq fois.Observez les protoscolacées dans 0,1% d’éosine pendant cinq minutes pour déterminer la viabilité des protoscolèces au microscope optique. Utilisez des protoscolèces avec une viabilité d’au moins 95% pour la culture. Traiter le précipité des protoscolèces avec deux mL de pepsine pendant 15 à 20 minutes.Pour isoler les protoscolacées individuelles, ressuspendez les sédiments de protoscoleces dans le PBS et passez-les à travers deux couches de gaze stérile dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL. Deux, la culture biphasique de protoscolèces d’Echinococcus granulosus pour obtenir des vers adultes. Ajouter 10 mL du milieu de phase liquide à chaque fiole de culture de 25 centimètres carrés.Ajouter environ 5 000 protoscolèces à la fiole de culture et la transférer dans l’incubateur à CO2. Après 24 à 48 heures, transférer les protoscolèces dans une nouvelle fiole avec la phase solide et ajouter un mL du même milieu de phase liquide frais par fiole. Transférer les flacons dans l’incubateur, 37 degrés Celsius, 5% CO2.Tous les cinq à sept jours, remplacez le milieu par un milieu liquide frais. Trois, culture monophasique de protoscolèces d’un Echinococcus granulosus. Assurez-vous que la culture monophasique est faite 24 à 48 heures avant la transduction.Culture d’environ 5 000 protoscolèces dans une fiole de culture de 25 centimètres carrés avec RPMI et 10% FBS. Transférer les flacons dans l’incubateur à CO2 jusqu’à utilisation. Quatrièmement, la culture cellulaire pour la production et la préparation de virus.Transférer 500 000 cellules HEK dans une fiole de 25 centimètres carrés contenant 5 mL de DMEM avec 10% FBS, 100 U / mL de pénicilline et 100 microgrammes / mL de streptomycine. Incuber les cellules HEK2 à 37 degrés Celsius dans 5% de CO2 et les passer dans le milieu de culture complet toutes les 48 heures. Enfin, utilisez des cellules HEK à faible passage pour la transduction.Cinquièmement, la production et la préparation du virus avec les vecteurs lentiviraux de troisième génération. Le premier jour, après avoir essayé les cellules HEK dans une plaque de culture à 6 puits, ensemencez 70 000 cellules par puits avec du DMEM frais sans antibiotique contenant 10% de FBS. Utilisez des cellules à une confluence de 50 à 60% pour la transduction par la méthode du phosphate de calcium.Deuxième jour, remplacez le milieu de culture cellulaire deux à trois heures avant l’expérience par du DMEM frais sans antibiotique contenant 2% de FBS. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger des plasmides lentiviraux de troisième génération, y compris 7 microgrammes/microlitres de vecteur de transfert pCDH513b, 4 microgrammes/microlitres PLPII, 4 microgrammes/microlitres PLPI et 2 microgrammes/microlitres PMD2G vecteurs auxiliaires. Ajouter le tampon HEPES au mélange pour atteindre le volume de 422 microlitres.Ajouter 16 microlitres de tampon 1% TE au mélange. Ajouter 62 microlitres de 2,5 mL de chlorure de calcium aux tubes et bien mélanger. Ajouter 500 microlitres de 2x tampon HBS au mélange, goutte à goutte en une à deux minutes à l’aide d’une pipette Pasteur.Mélanger doucement jusqu’à l’obtention d’une solution semi-opaque et incuber le mélange pendant 20 minutes à température ambiante. À la fin, ajoutez lentement le mélange à chaque plaque et répartissez-le avec des mouvements circulaires lents. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5% de CO2 et remplacer le milieu après quatre à six heures par du DMEM sans antibiotique contenant 10% de FBS.Le troisième jour, confirmer la transduction transitoire réussie et la viabilité cellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée. Quatrième jour, récoltez les virus du milieu de culture en collectant le surnageant de chaque puits et stockez-les à 70 degrés Celsius négatifs jusqu’à leur utilisation. Six, transduction transitoire de différents stades d’Echinococcus granulosus avec le virus.Le premier jour, utilisez une plaque de culture à 12 puits pour le transfert de gènes. Culture 5 000 à 50 000 cellules HEK en triples avec un milieu DMEM complet comme référence interne. Culture 150 protoscolèces fraîches en triples dans RPMI et 10%FBS.Culture 30 vers strobilés en triple d’un DMEM et d’un FBS inactivé à 10 % par la chaleur. Préparez un mélange de 1 million de virus avec quatre microgrammes/mL de réactif de transfection pour transduire les cellules HEK et les différents stades du ver. Ajouter le mélange à chaque plaque lentement et le répartir avec des mouvements circulaires lents.Incuber les plaques pendant quatre à six heures dans un incubateur à CO2, 37 degrés Celsius, 5% CO2. Remplacer le milieu de chaque échantillon par le même milieu de culture complet pour minimiser les effets toxiques des réactifs de transfection. Deuxième jour, répétez deux étapes précédentes pour augmenter l’efficacité de la transduction transitoire pour les cellules HEK, les protoscolèces et les vers strobilés.Incuber toutes les plaques pendant 24 à 48 heures dans un incubateur à CO2 avec les mêmes conditions de culture en fonction du type de milieu cellulaire. Troisième jour, assurez-vous que la transduction est réussie en utilisant la microscopie à fluorescence. Résultats représentatifs.Nous décrivons ici une technique de transduction transitoire rapide et efficace chez Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération. Nous avons cultivé des protoscolèces dans des milieux de culture biphasiques pour obtenir des vers strobilés selon nos études précédentes. Les protoscoléces sont développés dans les vers strobilés après une culture in vitro de six semaines.Différents stades d’Echinococcus granulosus ont été observés dans le milieu de culture biphasique, y compris les protoscolèces invaginées, figure 2A, les protoscolèces evaginées, figure 2B, et les vers strobilés avec première et troisième formation de proglottes, figure 2C à E.Protoscoleces et les vers strobilés obtenus à partir de cultures monophasiques et biphasiques, respectivement, ont été transfectés par des lentivirus exprimant la GFP, figure 3. Les cellules HEK ont clairement exprimé la GFP en tant que contrôle transitoire du processus de transduction. Les vers adultes exprimaient la GFP le plus distinctement dans la couche tégumentale.Cependant, les protoscoléces ont démontré un niveau un peu plus faible d’expression de GFP après 48 heures. Certains résidus de liquide kystique et/ou débris de couche germinale autour des protoscolèces ont provoqué un fond de fluorescence dans les échantillons transfectés. L’intensité de la fluorescence dans les cellules HEK et les vers strobilés a augmenté après 24 et 48 heures.Comprendre la base moléculaire des nématodes et la biologie de Platyhelminthes est l’une des frontières les plus importantes de la pathogénicité des parasites zoonotiques. L’absence d’un système efficace d’évaluation des gènes est un obstacle majeur à l’interprétation directe de la génétique fonctionnelle des parasites cestodes, y compris les espèces d’Echinococcus. L’objectif principal de ce travail était d’illustrer le processus de transduction du vecteur lentiviral qui sera critique dans la recherche future sur l’échinococcose.Les résultats montrent que les vers strobilés sont plus sensibles à la transduction transitoire du gène que les protoscolèces, ce qui peut être le résultat d’une structure tégumentale étendue dans les formes strobilées. Cependant, en raison de la nature de la transduction lentivirale, l’intensité de fluorescence dans les protoscolacées multicellulaires et les vers strobilés est généralement beaucoup plus faible que celle des cellules HEK monocouches. Il existe un besoin urgent de recherche génétique appliquée aux niveaux génomique et transcriptomique pour Echinococcus ainsi que d’une grande variété de systèmes modèles de vers plats parasites et libres.Par conséquent, le développement du processus de transfert de gènes aux ténias ouvre la voie à l’utilisation potentielle de nouvelles techniques telles que la cartographie génétique basée sur le virus ou l’édition de gènes médiée par CRISPR-Cas9. Ces travaux présentent la transduction lentivirale dans un modèle de ténia et démontrent des résultats prometteurs avec des implications potentielles pour la biologie des vers plats. Des études plus approfondies sont encore nécessaires pour améliorer les méthodes et développer l’applicabilité de ces techniques pour de futures expériences.

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Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

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