Name: Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Apprenez à analyser les expectorations par cytométrie en flux pour le diagnostic clinique. Cette méthode optimise le comptage cellulaire et la caractérisation des sous-populations dans les maladies pulmonaires.

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Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation de la figure. Des échantillons d’expectorations ont été exécutés sur le BD LSR II à l’UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, soutenu par UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC à UT Health) et UL1 TR001120 (subvention CTSA).

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.
1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations
<ol><li>Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation. ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément aux instructions du fabricant et congeler à -20 °C dans des aliquotes de 25 mL jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Approximer le poids de l’échantillon et décongeler suffisamment 0,1 % de dithiothréitol (TNT) pour l’étape 2.2 et l’amener à 37 °C. (Les aliquotes de TNT doivent être conservées à -20 °C avant utilisation.)</li>
	<li>Apportez suffisamment de 0,5 % de N-acétyl-L-cystéine (NAC) jusqu’à 37 °C pour l’étape 2.2. (Le NAC doit être préparé frais chaque semaine et conservé à 4 °C avant utilisation.)</li>
</ol>2. Dissociation des expectorations
<ol><li>Peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation. REMARQUE: Un échantillon est considéré comme petit si le poids initial est de ≤3 g, moyen s’il est >3 g mais ≤8 g, grand s’il >8 mais ≤16 g et extra-grand si un échantillon pèse >16 g. Les indications petite, moyenne, grande et extra-large seront utilisées tout au long du protocole. La quantité de réactifs nécessaires à la dissociation et au marquage diffère selon la taille de l’échantillon d’expectorations.</li>
	<li>Transférer un petit échantillon dans un tube conique propre de 50 mL, un échantillon moyen dans une bouteille jetable en plastique propre de 250 mL ou un échantillon grand et extra-large dans une bouteille jetable en plastique propre de 500 mL. Ajouter 1 mL/g de poids d’échantillon de 0,5 % de NAC et 4 mL/g de poids d’échantillon de 0,1 % de TNT.</li>
	<li>Vortex à vitesse maximale (pendant 15 s), puis roche à température ambiante (à vitesse maximale) pendant 15 min.</li>
	<li>Diluer l’échantillon avec quatre volumes de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (en fonction du volume total de l’échantillon + réactifs) pour neutraliser le NAC et la TNT; vortex rapidement à vitesse maximale et roche à température ambiante pendant 5 min à vitesse maximale.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers une ou plusieurs crépines de cellules en maille de nylon de 100 μm dans un ou plusieurs tubes de centrifugeuse coniques de 50 mL pour créer une suspension à cellule unique.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant, combiner toutes les pastilles dans un tube conique de 15 mL, puis laver les pastilles avec HBSS dans les mêmes conditions.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations. REMARQUE : Un petit échantillon est remis en suspension dans 250 μL de HBSS. Un échantillon moyen est remis en suspension dans 760 μL de HBSS. Les échantillons de grande taille et de très grande taille sont remis en suspension dans 1460 μL de HBSS.</li>
	<li>Prenez une aliquote de la suspension cellulaire pour un comptage de cellules vivantes / mortes en utilisant Trypan Blue. REMARQUE: Pour un petit échantillon, utilisez 5 μL. Pour un échantillon moyen, grand ou extra-large, utilisez 10 μL. Diluer 1:10 avec HBSS.<ol>
<li>Mélanger 10 μL de dilution des expectorations avec 30 μL de 0,4 % de bleu de trypan pour obtenir une dilution finale de l’échantillon de 1:40. Chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un comptage cellulaire. REMARQUE: Il peut être nécessaire d’ajuster la dilution finale si le nombre de cellules est trop faible ou trop élevé pour obtenir un nombre précis. Il est fortement recommandé de consulter Guiot et al.20 pour distinguer correctement les cellules d’expectorations des SEC et des débris. Ceci est essentiel pour un comptage précis des cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De l’échantillon extra-large, retirez 50 x 106 cellules du total et ajoutez-les à un nouveau tube avec suffisamment de HBSS ajouté pour créer un volume total de 1700 μL. REMARQUE : Considérez qu’il s’agit d’un échantillon volumineux pour le reste du protocole. Les échantillons restants peuvent être jetés ou utilisés à d’autres fins.</li>
</ol>3. Coloration des anticorps et des colorants de viabilité
<ol><li>Choix de l’anticorps et du colorant NOTE : Le tableau 1 montre les anticorps et le colorant de viabilité utilisés dans ce protocole et les populations cellulaires qu’ils identifient.<ol>
<li>Étiqueter les tubes contenant les cellules d’expectorations (voir le tableau 2 pour les étiquettes).</li>
		<li>Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL (compatibles avec le cytomètre en flux utilisé) pour le tube d’échantillon avec les cellules non colorées et le tube avec le contrôle d’isotype. Utilisez des tubes coniques de 15 mL pour les échantillons de sang et de tubes épithéliaux. REMARQUE: Ces échantillons seront transférés dans des tubes de cytométrie en flux après la coloration et la fixation des anticorps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiquetez les tubes de compensation (tableau 3). REMARQUE: Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL compatibles avec le cytomètre en flux utilisé.</li>
	<li>Ajouter la quantité d’HBSS, d’anticorps et/ou de colorant à chacun des tubes cellulaires d’expectorations et des tubes de compensation comme indiqué dans les tableaux 2 et 3, respectivement. REMARQUE: Ajoutez un tampon (HBBS), des anticorps et un colorant à tous les tubes avant d’ajouter des cellules ou des perles de compensation pour vous assurer que le temps de coloration de tous les tubes est cohérent.</li>
	<li>Ajouter les quantités de volume de cellules d’expectorations indiquées dans le tableau 2 aux tubes d’essai.</li>
	<li>Ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme indiqué dans le tableau 3.</li>
	<li>Incuber tous les tubes (tubes d’essai et de compensation) sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 35 min. Ensuite, remplissez les tubes avec du HBSS glacé et centrifugez à 4 °C pendant 10 min à 800 x g.</li>
	<li>Pour les tubes de compensation, aspirez le surnageant aussi près que possible des pastilles et faites glisser les pastilles pour les desserrer.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de HBSS froid aux tubes de compensation, les stocker sur la glace à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’analyse par cytométrie en flux.</li>
	<li>Aspirer le surnageant de l’isotype, du sang et des tubes épithéliaux non colorés après la centrifugation (étape 3.6 de la section de coloration des anticorps) et desserrer les pastilles en agitant les tubes.</li>
</ol>4. Fixation avec 1% de paraformaldéhyde (PFA)
<ol><li>Ajouter du PFA froid de 1 % (qui devrait être décongelé maintenant) aux tubes non colorés, isotypes, sanguins et épithéliaux; 2 mL aux tubes non colorés et isotypes, et 10 mL aux tubes sanguins et épithéliaux.</li>
	<li>Incuber les tubes sur de la glace, à l’abri de la lumière pendant 1 h. Vortex rapidement à vitesse maximale après 30 min.</li>
	<li>Remplissez les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 10 min à 1600 x g.</li>
	<li>Aspirer autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faire glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes.</li>
	<li>Calculer le volume d’HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules. REMARQUE: Volume de remise en suspension = 0,15 x [nombre total de cellules (étape 8 de la dissociation des expectorations) / 106]. Utilisez 50 x 106 comme nombre de cellules pour un échantillon extra-large.</li>
	<li>Conservez tous les tubes d’échantillonnage et de compensation, à l’abri de la lumière sur la glace à 4 °C jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux soit effectuée. REMARQUE: Ce protocole n’a pas été testé pour le stockage depuis plus de 24 heures.</li>
</ol>5. Acquisition de données sur le cytomètre en flux
<ol><li>Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé. REMARQUE: Cette section du protocole suppose que la personne qui utilise le cytomètre en flux est formée à l’utilisation de l’instrument à sa disposition, en particulier en ce qui concerne les procédures quotidiennes, y compris la vérification de la stabilité des systèmes optiques et fluidiques, les techniques de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que le calcul et l’application de la matrice de compensation correcte.</li>
	<li>Utilisez le mélange de billes du National Institute of Standards and Technology (NIST) pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes NIST afin de couvrir toute la parcelle sans placer les perles trop près des axes. REMARQUE: Cette étape est cruciale pour s’assurer que les débris de moins de 5 μm peuvent être éliminés par une analyse post-acquisition de contrôle. Selon le cytomètre de flux utilisé, gardez à l’esprit que les plus petites billes ne sont pas exclues avec le seuil (lors de l’utilisation du LSR II ou du Lyric) ou avec le discriminateur élevé (en utilisant le cytomètre de flux Navios EX). Pour le Navios EX, un gain de 2 a été utilisé pour la diffusion avant et latérale, une tension de 236 pour la diffusion avant et de 250 pour la diffusion latérale. Pour le LSR II, une tension de diffusion directe de 165 et une tension de diffusion latérale de 190 ont été utilisées.</li>
	<li>Réglez le débit sur moyen (LSR II) ou élevé (Navios EX). REMARQUE: Le débit moyen ou élevé de la plupart des instruments peut être utilisé pour acquérir les tubes d’expectorations. Il est important de noter que l’utilisation d’un débit trop lent ou trop dilué de l’échantillon peut entraîner la sédimentation des cellules, entraînant une augmentation du vortex qui n’est pas souhaitée. Par conséquent, le respect du volume de remise en suspension calculé à l’étape 4.6 devrait entraîner une densité cellulaire qui peut être acquise rapidement mais ne pas obstruer la machine.</li>
	<li>Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires sur l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide sur la façon d’ajuster les tensions en conséquence. Remarque : Assurez-vous que tous les paramètres nécessaires sont sélectionnés dans la fenêtre de sélection des paramètres avant l’acquisition ou que les données ne seront pas acquises.</li>
	<li>Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré par isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial. REMARQUE: Si la suspension cellulaire est trop concentrée pour permettre au cytomètre en flux de faire fonctionner les échantillons sans obstruer, les échantillons peuvent être dilués avec HBSS.</li>
</ol>

Tous les auteurs sont des employés passés ou actuels de bioAffinity Technologies.

Le contenu cellulaire des expectorations comprend une grande variété de cellules très variées, souvent accompagnées de beaucoup de débris37. De plus, l’analyse des expectorations nécessite un contrôle de la qualité qui confirme que l’échantillon est prélevé dans les poumons au lieu de la cavité buccale38. Par conséquent, il n’est pas aussi simple d’analyser les expectorations par cytométrie en flux que pour le sang, par exemple, qui libère une suspension cellulaire beaucoup...

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8. Bien que la plupart des cellules des expectorations soient d’origine hématopoïétique9,10,11, la cytométrie en flux n’a pas été largement appliquée à l’analyse des expectorations à des fins diagnostiques. Cependant, plusieurs études suggèrent que l’évaluation des populations de cellules immunitaires dans les expectorations (le sous-ensemble de cellules le plus important) peut être d’une grande aide dans le diagnostic et / ou la surveillance de maladies telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)12,13,14,15. De plus, l’existence de marqueurs épithéliaux spécifiques qui peuvent être utilisés en cytométrie en flux permet l’interrogation du sous-ensemble de cellules le plus important suivant dans les expectorations, les cellules épithéliales pulmonaires.
En plus de la capacité d’analyser de nombreuses populations cellulaires distinctes d’origines tissulaires différentes, un cytomètre en flux peut évaluer un grand nombre de cellules dans une période relativement courte. En comparaison, les types d’analyses cytologiques à base de lames nécessitent souvent du personnel et/ou de l’équipement hautement spécialisés. Ces analyses peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre, ce qui conduit à l’analyse d’une partie seulement de l’échantillon d’expectorations16.
Trois problèmes critiques limitent l’utilisation généralisée des expectorations en cytométrie en flux. La première question concerne la collecte des expectorations. Les expectorations sont recueillies par une toux qui expulse le mucus des poumons dans la cavité buccale, puis crache dans une tasse de collecte. Étant donné que le mucus se déplace à travers la cavité buccale, il y a un risque élevé de contamination par la SEC. Cette contamination complique l’analyse de l’échantillon, mais le problème est facilement rectifié sur une plate-forme cytométrique en flux, comme le montre cette étude.
Tout le monde ne peut pas produire des expectorations spontanément; par conséquent, plusieurs dispositifs ont été mis au point pour faciliter la collecte des expectorations de manière non invasive17. Le nébuliseur est l’un de ces dispositifs et il a été démontré qu’il produisait des échantillons d’expectorations fiables18,19,20. Bien que le nébuliseur soit un moyen très efficace de collecter les expectorations de manière non invasive, son utilisation nécessite toujours un réglage dans un établissement médical avec du personnel spécialisé21. En revanche, les appareils portatifs tels que la flûte pulmonaire22,23,24 et l’acapella16,25 peuvent être utilisés à la maison car ils sont très conviviaux. Ces dispositifs d’assistance sont à la fois sûrs et rentables.
Pour nous, l’acapella a toujours donné de meilleurs résultats que la flûte pulmonaire16, et par conséquent, le dispositif acapella a été choisi pour les collections d’expectorations. Un échantillon de prélèvement de 3 jours a été décidé parce que le but principal de l’utilisation des expectorations est de développer un test de détection du cancer du poumon16. Il a été démontré qu’un échantillon de 3 jours augmente la probabilité de détection du cancer du poumon par rapport à un échantillon de 1 ou 2 jours26,27,28. Cependant, d’autres méthodes de collecte des expectorations peuvent être préférables à des fins différentes. Si une méthode de collecte des expectorations différente de celle décrite ici est utilisée, il est recommandé de titrer soigneusement chaque anticorps ou colorant utilisé pour l’analyse cytométrique en flux; très peu de données sont disponibles sur la façon dont les différentes méthodes de collecte des expectorations affectent les protéines ciblées pour la cytométrie en flux.
Le deuxième problème qui atténue l’enthousiasme pour l’utilisation des expectorations pour le diagnostic, principalement lié à la cytométrie en flux, est le nombre de cellules. Le problème est la collecte de suffisamment de cellules viables pour une analyse fiable. Deux études ont démontré que les échantillons d’expectorations prélevés par des méthodes non invasives, à l’aide d’un dispositif d’assistance, contiennent suffisamment de cellules viables pouvant être utilisées dans le diagnostic clinique ou les études de recherche16,24. Cependant, aucune de ces études n’a abordé la question du nombre de cellules concernant la cytométrie en flux.
Pour les études qui constituent la base de ce protocole, des échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des participants à risque élevé de développer un cancer du poumon conformément aux directives institutionnelles approuvées pour chaque site d’étude. Les participants à risque élevé ont été définis comme étant âgés de 55 à 75 ans, ayant fumé 30 paquets-années et n’ayant pas cessé de fumer au cours des 15 dernières années. On a montré aux patients comment utiliser le dispositif acapella conformément aux instructions du fabricant29 et ont recueilli des expectorations pendant trois jours consécutifs à la maison. L’échantillon a été conservé au réfrigérateur jusqu’à la dernière collecte. Le dernier jour du prélèvement, l’échantillon a été expédié au laboratoire pendant la nuit avec un compresse froid congelé. Les échantillons ont été transformés en une suspension à cellule unique le jour de leur réception. Avec cette méthode de collecte des expectorations, on obtient plus qu’assez de cellules viables pour une analyse cytométrique en flux fiable.
Enfin, et en relation avec le problème précédent du nombre de cellules, il y a la question de savoir comment libérer les cellules des expectorations de leur environnement mucineux. Comment les cellules peuvent-elles rester viables et créer une suspension cellulaire unique qui n’obstrue pas le cytomètre en flux? Basé sur les travaux initiaux de Pizzichini et al.30 et Miller et al.31, ce protocole décrit une méthode facile et fiable pour le traitement des expectorations en une suspension à cellule unique qui convient à l’analyse cytométrique en flux. Cette méthode a utilisé des lignes directrices bien établies en cytométrie en flux32,33,34 pour développer une stratégie efficace de marquage des anticorps afin d’identifier les cellules hématopoïétiques et épithéliales dans les expectorations et de fournir des paramètres d’instrument, des mesures de contrôle de la qualité et des lignes directrices d’analyse normalisant l’analyse des expectorations sur une plate-forme cytométrique en flux.

<table><tbody><tr><td>1 % Paraformaldéhyde Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro ; Filtres à cellules en nylon M, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube conique Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 CD3 BioLegend 300415</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 cytokératine humaine</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK, CD3 et CD19 Isotype</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 anti-humain CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Perles de compensation</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning Bouteille stérile jetable en polystyrène 250 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille stérile jetable en polystyrène Corning 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& Perles en T</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humain CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST Perles, 05 &mu ; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST Perles, 20 &mu ; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>Perles NIST, 30 &mu ; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humain CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 anti-humain EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 anti-humain CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu trypan, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

Les expectorations, largement utilisées pour étudier le contenu cellulaire et d’autres caractéristiques microenvironnementales afin de comprendre la santé du poumon, sont traditionnellement analysées à l’aide de méthodologies cytologiques. Son utilité est limitée car la lecture des diapositives prend beaucoup de temps et nécessite un personnel hautement spécialisé. De plus, des débris étendus et la présence d’un trop grand nombre de cellules épithéliales squameuses (ETC), ou cellules des joues, rendent souvent un échantillon inadéquat pour le diagnostic. En revanche, la cytométrie en flux permet un phénotypage à haut débit des populations cellulaires tout en excluant simultanément les débris et les SEC.
Le protocole présenté ici décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire, tacher les anticorps et fixer les populations cellulaires, et acquérir des échantillons sur une plate-forme cytométrique en flux. Une stratégie de contrôle qui décrit l’exclusion des débris, des cellules mortes (y compris les SEC) et des doublets cellulaires est présentée ici. En outre, ce travail explique également comment analyser des cellules d’expectorations uniques viables basées sur un groupe de populations positives et négatives de différenciation (CD)45 pour caractériser des sous-ensembles de lignées hématopoïétiques et épithéliales. Une mesure de contrôle de la qualité est également fournie en identifiant les macrophages spécifiques aux poumons comme preuve qu’un échantillon est dérivé du poumon et n’est pas de la salive. Enfin, il a été démontré que cette méthode peut être appliquée à différentes plateformes cytométriques en fournissant des profils d’expectorations du même patient analysés sur trois cytomètres de flux; Navios EX, LSR II et Lyric. De plus, ce protocole peut être modifié pour inclure des marqueurs cellulaires supplémentaires d’intérêt. Une méthode d’analyse d’un échantillon d’expectorations entier sur une plate-forme cytométrique en flux est présentée ici qui rend les expectorations utilisables pour le développement de diagnostics à haut débit des maladies pulmonaires.

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans perte de temps. Un comptage cellulai...

Ce protocole décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire et la caractérisation ultérieure de sous-ensembles cellulaires sur des plateformes cytométriques en flux standard.

Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

Ce protocole résout les problèmes courants rencontrés avec le traitement des expectorations qui ont rendu difficile dans le passé l’utilisation avec la cytométrie en flux à des fins de diagnostic clinique à haut débit. Ce protocole est conçu pour gagner du temps en utilisant le poids des expectorations pour déterminer les volumes de coloration des anticorps et des colorants. Pendant l’incubation de la coloration, le comptage cellulaire peut être effectué pour les étapes en aval.Il est important d’obtenir un nombre précis de cellules pour déterminer le volume de ressissage correct afin d’éviter tout problème lors de l’exécution sur le cytomètre de flux. Ce protocole peut donner un aperçu des domaines de recherche qui étudient la santé pulmonaire. Par exemple, des maladies telles que la MPOC, l’asthme, le cancer du poumon ou les effets de la COVID pourraient être étudiés.Le Dr Michael Lai, un scientifique en recherche et développement de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation. Transférer l’échantillon dans le récipient de taille appropriée en fonction du poids des expectorations, puis ajouter un millilitre par gramme de 0,5 % NAC et quatre millilitres par gramme de 0,1 % DTT.Vortex les échantillons à la vitesse maximale pendant 15 secondes et roche à vitesse maximale pendant 15 minutes à température ambiante. Diluer cet échantillon avec une solution saline équilibrée 4X Hanks ou HBSS pour neutraliser le NAC et le DTT. Et après un vortex rapide, faites basculer l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.Filtrer la suspension de la cellule à travers une passoire à cellules maillées en nylon de 100 micromètres dans un ou plusieurs tubes centrifuges coniques de 50 millilitres pour créer une suspension à cellule unique. Pelletez les cellules. Après avoir aspiré le surnageant, mélanger les granulés dans un tube conique de 15 millilitres et laver avec HBSS dans les mêmes conditions.Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire et mélangez 10 microlitres de la dilution des expectorations avec 30 microlitres de bleu de trypan à 0,4%, puis chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un nombre de cellules vivantes / mortes. Étiquetez les expectorations dans les tubes de compensation.Ajouter l’anticorps et le colorant HBSS à chaque tube de cellules d’expectorations et tubes de compensation comme indiqué dans le texte. Ajoutez les cellules d’expectorations aux tubes d’essai et ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme mentionné dans le texte. Incuber tous les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 35 minutes.Ensuite, après avoir rempli les tubes avec du HBSS glacé, centrifuger à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 800 fois G.Pour les tubes de compensation, aspirer le surnageant aussi près que possible des pastilles et faire glisser les pastilles pour les desserrer. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de HBSS froid aux tubes de compensation et stockez les tubes sur la glace dans une zone protégée de la lumière jusqu’à ce que cela soit nécessaire pour l’analyse de cytométrie en flux. Ensuite, aspirez le surnageant des expectorations non colorées, de l’isotype, du sang et des trompes épithéliales.Desserrez les granulés en agitant les tubes. Ajouter deux millilitres de PFA à 1% aux tubes non colorés et isotypes et 10 millilitres aux tubes sanguins et épithéliaux. Incuber les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes, puis vortex rapidement à la vitesse maximale et incuber à nouveau pendant 30 minutes supplémentaires.Remplissez ensuite les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1 600 fois G.Aspirez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faites glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules, puis ajoutez 200 microlitres de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes. Calculer et ajouter le volume requis de HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.Stocker tous les échantillons dans des tubes de compensation protégés de la lumière sur la glace à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’analyse de cytométrie en flux soit effectuée. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé. Utilisez le mélange de perles du National Institute of Standards and Technology ou du NIST pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes du NIST pour couvrir la parcelle sans placer les perles trop près des axes.Réglez le débit sur moyen pour LSRII ou élevé pour Navios EX. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires à l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide pour ajuster les tensions en conséquence. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré de l’isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.Le poids des expectorations a été utilisé pour déterminer les volumes d’anticorps ou de colorants pour la coloration. La corrélation entre le poids des expectorations et le rendement cellulaire n’était pas forte. Les échantillons d’expectorations ont été divisés en quatre catégories de poids, qui se regroupaient dans la distribution du rendement cellulaire.Chaque anticorps utilisé a été titré dans une concentration sur la phase de plateau avec l’indice de coloration le plus élevé a été choisi comme concentration de travail. Dans toutes les catégories de poids, la contamination moyenne par la SEC était inférieure à 20 %, le pourcentage de cellules viables étant indiqué. La stratégie de contrôle utilisée pour l’analyse est présentée.Les perles du NIST ont été utilisées pour fixer une grille qui a été appliquée sur l’échantillon d’expectorations pour éliminer les débris. Les petits débris ont ensuite été éliminés par la porte de largeur. Le colorant de viabilité a été utilisé pour éliminer les cellules mortes, tandis que la porte singlet a éliminé les doublets.Le marquage des anticorps anti-CD45 a permis la séparation de cellules d’expectorations uniques vivantes en une cellule sanguine et un compartiment non cellulaire. Les profils obtenus de Navios EX, LSRII et Lyric ont été comparés. La stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les cellules mortes, les doublets et comparer les profils sanguins et non sanguins est montrée.Cette technique nous a permis d’appliquer ces méthodes pour détecter le risque de cancer du poumon pour une utilisation comme test clinique non invasif.

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