Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Ce protocole résout les problèmes courants rencontrés avec le traitement des expectorations qui ont rendu difficile dans le passé l’utilisation avec la cytométrie en flux à des fins de diagnostic clinique à haut débit. Ce protocole est conçu pour gagner du temps en utilisant le poids des expectorations pour déterminer les volumes de coloration des anticorps et des colorants. Pendant l’incubation de la coloration, le comptage cellulaire peut être effectué pour les étapes en aval.

Il est important d’obtenir un nombre précis de cellules pour déterminer le volume de ressissage correct afin d’éviter tout problème lors de l’exécution sur le cytomètre de flux. Ce protocole peut donner un aperçu des domaines de recherche qui étudient la santé pulmonaire. Par exemple, des maladies telles que la MPOC, l’asthme, le cancer du poumon ou les effets de la COVID pourraient être étudiés.

Le Dr Michael Lai, un scientifique en recherche et développement de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation. Transférer l’échantillon dans le récipient de taille appropriée en fonction du poids des expectorations, puis ajouter un millilitre par gramme de 0,5 % NAC et quatre millilitres par gramme de 0,1 % DTT.

Vortex les échantillons à la vitesse maximale pendant 15 secondes et roche à vitesse maximale pendant 15 minutes à température ambiante. Diluer cet échantillon avec une solution saline équilibrée 4X Hanks ou HBSS pour neutraliser le NAC et le DTT. Et après un vortex rapide, faites basculer l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes.

Filtrer la suspension de la cellule à travers une passoire à cellules maillées en nylon de 100 micromètres dans un ou plusieurs tubes centrifuges coniques de 50 millilitres pour créer une suspension à cellule unique. Pelletez les cellules. Après avoir aspiré le surnageant, mélanger les granulés dans un tube conique de 15 millilitres et laver avec HBSS dans les mêmes conditions.

Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire et mélangez 10 microlitres de la dilution des expectorations avec 30 microlitres de bleu de trypan à 0,4%, puis chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un nombre de cellules vivantes / mortes. Étiquetez les expectorations dans les tubes de compensation.

Ajouter l’anticorps et le colorant HBSS à chaque tube de cellules d’expectorations et tubes de compensation comme indiqué dans le texte. Ajoutez les cellules d’expectorations aux tubes d’essai et ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme mentionné dans le texte. Incuber tous les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 35 minutes.

Ensuite, après avoir rempli les tubes avec du HBSS glacé, centrifuger à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 800 fois G.Pour les tubes de compensation, aspirer le surnageant aussi près que possible des pastilles et faire glisser les pastilles pour les desserrer. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de HBSS froid aux tubes de compensation et stockez les tubes sur la glace dans une zone protégée de la lumière jusqu’à ce que cela soit nécessaire pour l’analyse de cytométrie en flux. Ensuite, aspirez le surnageant des expectorations non colorées, de l’isotype, du sang et des trompes épithéliales.

Desserrez les granulés en agitant les tubes. Ajouter deux millilitres de PFA à 1% aux tubes non colorés et isotypes et 10 millilitres aux tubes sanguins et épithéliaux. Incuber les tubes sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes, puis vortex rapidement à la vitesse maximale et incuber à nouveau pendant 30 minutes supplémentaires.

Remplissez ensuite les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1 600 fois G.Aspirez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faites glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules, puis ajoutez 200 microlitres de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes. Calculer et ajouter le volume requis de HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.

Stocker tous les échantillons dans des tubes de compensation protégés de la lumière sur la glace à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’analyse de cytométrie en flux soit effectuée. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé. Utilisez le mélange de perles du National Institute of Standards and Technology ou du NIST pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes du NIST pour couvrir la parcelle sans placer les perles trop près des axes.

Réglez le débit sur moyen pour LSRII ou élevé pour Navios EX. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires à l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide pour ajuster les tensions en conséquence. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré de l’isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.

Le poids des expectorations a été utilisé pour déterminer les volumes d’anticorps ou de colorants pour la coloration. La corrélation entre le poids des expectorations et le rendement cellulaire n’était pas forte. Les échantillons d’expectorations ont été divisés en quatre catégories de poids, qui se regroupaient dans la distribution du rendement cellulaire.

Chaque anticorps utilisé a été titré dans une concentration sur la phase de plateau avec l’indice de coloration le plus élevé a été choisi comme concentration de travail. Dans toutes les catégories de poids, la contamination moyenne par la SEC était inférieure à 20 %, le pourcentage de cellules viables étant indiqué. La stratégie de contrôle utilisée pour l’analyse est présentée.

Les perles du NIST ont été utilisées pour fixer une grille qui a été appliquée sur l’échantillon d’expectorations pour éliminer les débris. Les petits débris ont ensuite été éliminés par la porte de largeur. Le colorant de viabilité a été utilisé pour éliminer les cellules mortes, tandis que la porte singlet a éliminé les doublets.

Le marquage des anticorps anti-CD45 a permis la séparation de cellules d’expectorations uniques vivantes en une cellule sanguine et un compartiment non cellulaire. Les profils obtenus de Navios EX, LSRII et Lyric ont été comparés. La stratégie de contrôle pour éliminer les débris, les cellules mortes, les doublets et comparer les profils sanguins et non sanguins est montrée.

Cette technique nous a permis d’appliquer ces méthodes pour détecter le risque de cancer du poumon pour une utilisation comme test clinique non invasif.