Name: Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez l'imagerie mésoscopique du cœur entier de souris par microscopie à feuille de lumière. Cette méthode combine clarification tissulaire et balayage axial pour préserver l'organisation tridimensionnelle cardiaque.

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Ce projet a reçu des financements du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n ° 952166 (REPAIR), MUR dans le cadre du programme FISR, projet FISR2019_00320 et Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, projet PERCARE.

Toutes les manipulations et procédures des animaux ont été effectuées conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et conformes aux principes et règlements du ministère italien de la Santé. Le protocole expérimental a été approuvé par le ministère italien de la Santé (protocole numéro 647/2015-PR). Tous les animaux ont été fournis par ENVIGO, Italie. Pour ces expériences, 5 souris mâles C57BL/6J âgées de 6 mois ont été utilisées.
1. Préparation de la solution
<ol><li>Préparer 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,6) dans une hotte chimique. Conservez les aliquotes PFA à 4 % à -20 °C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer la solution d’hydrogel: Mélanger 4% d’acrylamide, 0,05% de bis-acrylamide, 0,25% d’initiatior AV-044 dans 0,01 M PBS dans une hotte chimique. Gardez les réactifs et la solution sur la glace pendant toute la préparation. Conservez les aliquotes d’hydrogel à -20 °C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer la solution de nettoyage: Mélanger 200 mM d’acide borique, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l’eau désionisée; pH 8,6 dans une hotte chimique. Conserver la solution entre 21 et 37 °C pour éviter les précipitations de SDS.</li>
	<li>Préparer une solution fraîche de Tyrode le jour de l’expérience: Ajouter 10 mM de glucose, 10 mM HEPES, 113 mM de NaCl, 1,2 mM de MgCl2 et 4,7 mM de KCl; titrer à pH 7,4 en utilisant 1 M NaOH.</li>
</ol>2. Isolement cardiaque
<ol><li>Injecter 0,1 mL de 500 U.U. Héparine par voie sous-cutanée 30 minutes avant la procédure d’isolement cardiaque.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 30 ml et trois boîtes de Petri de 6 cm avec une solution de Tyrode fraîche. Faites une petite faille (3-4 mm de profondeur) sur le bord de l’une des boîtes de Petri et placez-la sous un microscope stéréoscopique.</li>
	<li>Fixez une canule de 1 mm de diamètre à la seringue et insérez-la dans la faille de la boîte de Pétri. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 20 ml avec du PFA à 4 % et conservez-la dans le capot chimique. Préparez une boîte de Petri vide sous le capot.</li>
	<li>Anesthésier la souris avec 3% d’isoflurane/oxygène à un débit de 1,0 L/min et la sacrifier par luxation cervicale selon les règles de bien-être animal en vigueur.</li>
	<li>Après le sacrifice, retirez la fourrure sur la poitrine et ouvrez la poitrine pour avoir un accès complet au cœur.</li>
	<li>Isoler le cœur, l’immerger dans la boîte de Petri préalablement remplie de 50 ml de solution Tyrode. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper l’aorte immédiatement près de l’arc aortique afin d’exposer le cœur.</li>
	<li>Transférer le cœur au microscope stéréoscopique et effectuer soigneusement la canulation. N’insérez pas la canule trop profondément dans l’aorte (pas plus de 2 mm) pour éviter des lésions tissulaires.</li>
	<li>Utilisez une petite pince et une suture (taille 5/0) pour fixer le cœur à la canule.</li>
	<li>Perfuser le cœur avec 30 mL de la solution Tyrode avec une pression constante de 10 mL/min pour éliminer le sang des vaisseaux.</li>
	<li>Détachez la canule de la seringue et placez le cœur dans la boîte de Petri remplie de solution Tyrode. Veillez à ne pas avoir de bulles d’air dans la canule; Sinon, retirez les bulles d’air correctement.</li>
	<li>Fixez la seringue de 20 ml remplie de PFA froid à 4% à la canule et perfuser le cœur à la même pression constante.</li>
	<li>Incuber le cœur dans 10 mL de PFA à 4 % à 4 °C pendant une nuit (O/N). Pour éviter la dégradation des tissus, effectuez les étapes 2.6-2.13 dans les plus brefs délais.</li>
</ol>3. Nettoyage du cœur
<ol><li>Le lendemain, laver le cœur dans 0,01 M PBS 3 fois à 4 °C pendant 15 min. REMARQUE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% d’azoture de sodium (NaN3) à 4 ° C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Incuber le cœur dans 30 mL de solution d’hydrogel en secouant (15 rpm) à 4 °C pendant 3 jours.</li>
	<li>Dégazez l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la pompe et à un pipeline d’azote.<ol><li>Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus.</li>
		<li>Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.</li>
		<li>Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 min.</li>
		<li>Éteignez la pompe et utilisez le bouton de la sécheuse pour ouvrir la canalisation d’azote. Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon.</li>
	</ol></li>
	<li>Maintenir le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 °C pendant 3 h au repos.</li>
	<li>Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et apparaît entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans le porte-échantillon.</li>
	<li>Insérez le porte-échantillon avec le cœur dans l’une des chambres de nettoyage et fermez-le correctement pour éviter les fuites de la solution de nettoyage.</li>
	<li>Allumez le bain-marie où le récipient de solution de nettoyage est placé et la pompe péristaltique pour démarrer la recirculation de la solution de nettoyage.</li>
	<li>Changez la solution de dédouanement dans le conteneur une fois par semaine pour accélérer la procédure de clarification.</li>
</ol>4. Coloration de la membrane cellulaire
<ol><li>Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du porte-échantillon et lavez-le dans 50 ml de PBS réchauffé pendant 24 heures. Laver à nouveau dans 50 ml de PBS + 1% de Triton-X (PBS-T 1x) pendant 24 h.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans 0,01 mg/mL d’agglutinine germée de blé (WGA) - Alexa Fluor 633 dans 3 mL de PBS-T 1x en agitation (50 rpm) à température ambiante pendant 7 jours.</li>
	<li>Après l’incubation de 7 jours, laver l’échantillon dans 50 mL de PBS-T 1x à température ambiante en agitant pendant 24 h.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 min, puis le laver 3 fois dans PBS pendant 5 min chacun. NOTE: Après cette étape, le cœur peut être stocké dans PBS + 0,01% NaN3 à 4 ° C pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Incuber le cœur à des concentrations croissantes de 2,2′-thiodiéthanol (TDE) dans 0,01 M PBS (20% et 47% TDE/PBS) pendant 8 h chacun, jusqu’à la concentration finale de 68% TDE dans 0,01 M PBS pour fournir l’indice de réfraction requis (RI = 1,46). Il s’agit du support de correspondance RI (RI-medium) pour acquérir des images16.</li>
</ol>5. Montage et acquisition du cœur
REMARQUE: Tous les composants du système optique sont énumérés en détail dans le tableau des matériaux.
<ol><li>Remplir délicatement environ 80% de la cuvette externe (quartz, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) avec le milieu RI. REMARQUE: Ici, il est possible d’utiliser différentes solutions non volatiles qui garantissent un RI de 1,46.</li>
	<li>Remplir délicatement la cuvette interne (quartz, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) avec le même milieu RI.</li>
	<li>Immergez l’échantillon à l’intérieur de la cuvette interne. Les incubations de l’échantillon décrites ci-dessus permettent à l’échantillon de rester stable à l’intérieur du milieu IR sans être maintenu.</li>
	<li>Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la cuvette à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal de la cuvette pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.</li>
	<li>Fixez délicatement le bouchon sur mesure au-dessus de la cuvette interne à l’aide de deux vis.</li>
	<li>Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide des aimants.</li>
	<li>Traduisez manuellement l’étage d’échantillonnage vertical pour immerger la cuvette interne dans la cuvette externe.</li>
	<li>Allumez la source lumineuse d’excitation (longueur d’onde de 638 nm), en réglant une faible puissance (de l’ordre de 3 mW).</li>
	<li>Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer un plan interne du tissu.</li>
	<li>Allumez le logiciel d’imagerie (HCImageLive) et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode externe (feuille de lumière) pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.</li>
	<li>Activez l’enregistrement automatique dans le panneau Paramètres de numérisation et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées.</li>
	<li>Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan XY avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du FoV du capteur de caméra.</li>
	<li>Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.</li>
	<li>Augmentez la puissance laser à ~20 mW, prêt pour la session d’imagerie.</li>
	<li>Démarrez l’acquisition tomographique, cliquez sur le bouton Démarrer dans le panneau de séquence du logiciel d’imagerie, et en même temps déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de 6 μm/s à l’aide du traducteur motorisé.</li>
</ol>

<ol><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications%3A+A+consensus+paper+from+an+International+Forum+on+Cardiac+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).</li>
<li>Finocchiaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrhythmogenic+potential+of+myocardial+disarray+in+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+genetic+basis%2C+functional+consequences+and+relation+to+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22EP+Europace%22%5BJournal%5D)">Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death.</a> EP Europace. 2, 1-11 (2021).</li>
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<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106, 369-387 (2020).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+of+fixed+tissue%3A+a+review+from+a+microscopist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+tissue+physicochemical+properties+using+polyfunctional+crosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers.</a> Nature Biotechnology. 37, 73(2019).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+the+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769(2018).</li>
<li>Olianti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+and+morphometry+of+the+heart+capillary+system+in+spontaneously+hypertensive+rats+and+normotensive+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls.</a> Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).</li>
<li>Pianca, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+innervation+network+shapes+the+myocardium+by+locally+controlling+cardiomyocyte+size+through+the+cellular+proteolytic+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery.</a> The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).</li>
<li>Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+clearer+view+of+sympathetic+innervation+of+cardiac+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).</li>
<li>Voigt, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesoSPIM+initiative+-+open-source+light-sheet+microscopes+for+imaging+cleared+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue.</a> Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5, 9808(2015).</li>
<li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+transduction+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012(2016).</li>
<li>Yi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+prediction+in+H%26E+stained+pathology+images+using+fully+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 64(2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1982(2020).</li>
</ol>

Rien à divulgation.

Dans ce travail, une approche réussie pour nettoyer, colorer et imager un cœur de souris entier à haute résolution a été introduite. Tout d’abord, un protocole de transformation tissulaire (CLARITY) a été optimisé et réalisé, légèrement modifié pour son application sur le tissu cardiaque. En effet, pour obtenir une reconstruction efficace en 3D de tout un cœur, il est indispensable de prévenir le phénomène de diffusion de la lumière. La méthodologie CLARITY nous permet d’obtenir un cœur intact très transparent, mais elle...

Le remodelage structurel associé aux maladies cardiaques peut affecter la conduction électrique et introduire des dysfonctionnements électromécaniques de l’organe 1,2. Les approches actuelles utilisées pour prédire les altérations fonctionnelles utilisent couramment l’IRM et l’IRM-DT pour obtenir une reconstruction globale du dépôt de fibrose, de l’arbre vasculaire et de la distribution des fibres du cœur, et elles sont utilisées pour modéliser les voies de propagation du potentiel d’action préférentielle (APP) à travers l’organe 3,4. Ces stratégies peuvent fournir un bel aperçu de l’organisation du cœur. Cependant, leur résolution spatiale est insuffisante pour étudier l’impact du remodelage structurel sur la fonction cardiaque au niveau cellulaire.
Il est difficile de placer ce cadre à un ordre de grandeur différent, où des cellules individuelles peuvent jouer des rôles individuels dans la propagation du potentiel d’action. La principale limitation est l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution (résolution micrométrique) dans des tissus massifs (de la taille d’un centimètre). En fait, l’imagerie de tissus biologiques en 3D à haute résolution est très compliquée en raison de l’opacité des tissus. L’approche la plus courante pour effectuer des reconstructions 3D dans des organes entiers consiste à préparer des sections minces. Cependant, un sectionnement, un assemblage et une imagerie précis nécessitent beaucoup d’efforts et de temps. Une approche alternative qui ne nécessite pas de couper l’échantillon consiste à générer un tissu transparent. Au cours des dernières années, plusieurs méthodologies de clarification des tissus ont été proposées 5,6,7,8. Le défi de produire des tissus massifs, transparents et marqués par fluorescence a récemment été relevé en développant de véritables approches de transformation tissulaire (CLARITY9, SHIELD10). En particulier, la méthode CLARITY est basée sur la transformation d’un tissu intact en une forme nanoporeuse, hybride hydrogel, sans lipides qui permet de conférer une grande transparence par l’élimination sélective des bicouches lipidiques membranaires. Notamment, cette méthode s’est avérée efficace également dans la préparation cardiaque11,12,13,14. Cependant, comme le cœur est trop fragile pour convenir à une clairière active, il doit être dégagé en utilisant l’approche passive, qui nécessite beaucoup de temps pour conférer une transparence complète.
En combinaison avec des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie à feuille de lumière, CLARITY a le potentiel d’imager en 3D des tissus cardiaques massifs à une résolution micrométrique. En microscopie à feuille de lumière, l’éclairage de l’échantillon est réalisé avec une fine feuille de lumière confinée dans le plan focal de l’objectif de détection. L’émission de fluorescence est recueillie le long d’un axe perpendiculaire au plan d’éclairage15. L’architecture de détection est similaire à la microscopie à grand champ, ce qui rend l’acquisition beaucoup plus rapide que les microscopes à balayage laser. Le déplacement de l’échantillon à travers la feuille lumineuse permet d’obtenir une tomographie complète de grands spécimens, jusqu’à des échantillons de la taille d’un centimètre. Cependant, en raison des propriétés intrinsèques du faisceau gaussien, il est possible d’obtenir une feuille de lumière très mince (de l’ordre de quelques microns) uniquement pour une extension spatiale limitée, limitant ainsi drastiquement le champ de vision (FoV). Récemment, un nouveau schéma d’excitation a été introduit pour surmonter cette limitation et appliqué à l’imagerie cérébrale, permettant des reconstructions 3D avec une résolution isotrope16.
Dans ce document, une approche de compensation passive est présentée, permettant une réduction significative du délai de compensation requis par le protocole Clarity. Le cadre méthodologique décrit ici permet de reconstruire un cœur entier de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique avec un temps d’acquisition de l’ordre de quelques minutes.

<table><tbody><tr><td>2-2' Thiodiéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>61-0140</td><td></td></tr><tr><td>AV-044 Initiateur</td><td>Wako Chemicals</td><td>AVP5874</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>161-042</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca flash 4.0 v3</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de l’appareil photo</td><td>Hamamatsu</td> HC Objectif de collimation <td>d’image</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Bras de détection</td><td>Optique intégrée</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Lentille d’excitation</td><td>Nikon</td><td>91863</td><td></td></tr><tr><td>Extera&igrave ; nal cuvette à quartz</td><td>Portmann Instruments</td><td>UQ-753</td><td></td></tr><tr><td>Miroirs pliants</td><td>Thorlabs</td><td>BBE1-E02</td><td></td></tr><tr><td>Miroir galvanométrique</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211/M</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu</td><td>4.6.1.19</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette interne</td><td>à quartz Portmann Instruments</td><td>UQ-204</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Source laser</td><td>Optique intégrée</td><td>0638L-15A-NI-PT-NF</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-long</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0650</td><td></td></tr><tr><td>Base magnétique</td><td>Thorlabs</td><td>KB25/M</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Chem-Lab</td><td>CI-1316-0250</td><td></td></tr><tr><td>Traslator motorisé</td><td>Physisk Instrument</td><td>M-122.2DD</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59888</td><td></td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Thorlabs</td><td>TL2X-SAP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr> Solution tampon de <tr><td>phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polycap AS</td><td>Whatman</td><td>2606T</td><td></td></tr><tr><td>Lentille relais</td><td>Qioptiq</td><td>G063200000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Lentille tubulaire</td><td>Thorlabs</td><td>ACT508-200-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lentille accordable</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>KNF Neuberger Inc</td><td>N86KT.18</td><td></td></tr><tr><td>Eau bain</td><td>Memmert</td><td>WTB</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Les maladies cardiaques génétiques et non génétiques peuvent provoquer de graves processus de remodelage dans le cœur. Le remodelage structurel, tel que le dépôt de collagène (fibrose) et le désalignement cellulaire, peut affecter la conduction électrique, introduire des dysfonctionnements électromécaniques et, éventuellement, conduire à une arythmie. Les modèles prédictifs actuels de ces altérations fonctionnelles sont basés sur des informations structurelles non intégrées et à faible résolution. Il est difficile de placer ce cadre dans un ordre de grandeur différent en raison de l’inefficacité des méthodes d’imagerie standard pour effectuer une imagerie à haute résolution dans des tissus massifs. Dans ce travail, nous décrivons un cadre méthodologique qui permet l’imagerie de cœurs de souris entiers avec une résolution micrométrique. La réalisation de cet objectif a nécessité un effort technologique où les progrès de la transformation tissulaire et des méthodes d’imagerie ont été combinés. Tout d’abord, nous décrivons un protocole CLARITY optimisé capable de transformer un cœur intact en une forme nanoporeuse, hybride d’hydrogel, sans lipides qui permet une transparence élevée et une coloration profonde. Ensuite, un microscope à feuille de lumière à fluorescence capable d’acquérir rapidement des images d’un champ de vision mésoscopique (échelle mm) avec une résolution à l’échelle du micron est décrit. Suite au projet mesoSPIM, le microscope conçu permet la reconstruction de l’ensemble du cœur de souris avec une résolution micrométrique en un seul balayage tomographique. Nous pensons que ce cadre méthodologique permettra de clarifier l’implication du désarroi de la cytoarchitecture dans les dysfonctionnements électriques et d’ouvrir la voie à un modèle complet qui prend en compte à la fois les données fonctionnelles et structurelles, permettant ainsi une étude unifiée des causes structurelles qui conduisent à des altérations électriques et mécaniques après le remodelage tissulaire.

La configuration de nettoyage passif développée permet d’obtenir un cœur de souris adulte dégagé (avec une dimension de l’ordre de 10 mm x 6 mm x 6 mm) en environ 3 mois. Tous les composants de la configuration sont montés comme illustré à la Figure 1. Le gradient de température négligeable entre chaque chambre de dégagement (de l’ordre de 3°C) permet de maintenir la température dans une plage appropriée dans toutes les chambres.
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Nous rapportons une méthode de reconstruction mésoscopique de l’ensemble du cœur de souris en combinant de nouvelles avancées dans la transformation tissulaire et la coloration avec le développement d’un microscope à feuille de lumière à balayage axial.

Imagerie optique mésoscopique du cœur entier de souris

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Cette méthodologie combine l’amélioration du protocole de dégagement avec la capacité oculaire de sectionnement optique de la technologie Mesos PIM nous permettant d’effectuer des reconstructions mésoscopiques à résolution micrométrique. Il offre la possibilité d’imager des tissus cardiaques massifs ou des cœurs entiers de souris en une seule analyse sans perdre l’organisation tissulaire tridimensionnelle d’origine. Une fois que le cœur a été canulé par l’aorte proximale lavée dans une solution tyro et fixée dans de l’aldéhyde paraforme à 4% dans du PBS 0,01 molaire, il est prêt à commencer le protocole de nettoyage.Lavez le cœur trois fois dans 0,01 molaire PBS à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cette étape, le cœur peut être stocké dans du PBS et de l’azoture de sodium à 0,01% à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois. Incuber le cœur dans 20 millilitres de solution d’hydrogel en état d’agitation à 15 RPM pendant trois jours à quatre degrés Celsius.Dégazer l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la bande de pompe et au pipeline d’azote. Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus. Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 minutes. Éteignez la pompe et ouvrez le bouton de la sécheuse jusqu’à la canalisation d’azote. Ouvrez ensuite le robinet d’azote.Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon. Gardez le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures au repos. Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et semble entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans une solution de clairance dans le flacon avec solution de clairage.Changez la solution de nettoyage dans le flacon une fois tous les trois jours pour accélérer la procédure de clarification. Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du flacon et lavez-le dans 50 millilitres de PBS réchauffé pendant 24 heures en état de tremblement. Laver à nouveau dans 50 millilitres d’un X PBS T pendant 24 heures en état d’agitation.Incuber l’échantillon dans 0,01 milligrammes par millilitres de germe de blé aglutinine Alexa plancher 633 dans trois millilitres d’un X PBS T en état d’agitation à 50 RPM à température ambiante pendant sept jours. Après l’incubation de sept jours, laver l’échantillon dans 50 millilitres d’un X PBS T à température ambiante en agitant pendant 24 heures. Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 minutes, puis le laver trois fois dans 0,01 molaire PBS pendant cinq minutes chacun.Incuber le cœur successivement dans 20 et 47% de TDE dans 0,01 molaire PBS pendant huit heures chacun. Et enfin à 68%TDE dans 0,01 molaire PBS pour fournir l’indice de réfraction requis de 1,46. Remplissez doucement environ 80% de la couvette de quartz externe avec le milieu d’indice de réfraction.Remplissez le quvet de quartz interne avec le même milieu d’indice de réfraction. Immergez l’échantillon dans le quvet interne. Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la pince à épiler à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal du quvet pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.Fixez soigneusement la fiche sur mesure au-dessus de la quvet interne avec deux vis. Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide d’aimants. Traduisez manuellement l’étape d’échantillonnage verticale pour immerger le quet interne dans le quet externe.Allumez la source lumineuse d’excitation avec une longueur d’onde de 638 nanomètres et réglez-la à faible puissance de l’ordre de trois milliwatts. Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer une plaque interne du tissu. Allumez le logiciel de la caméra en direct de l’image HC et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode feuille de lumière du déclencheur de bord externe pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.Activez l’enregistrement automatique dans le logiciel de l’appareil photo et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées. Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan X Y avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du champ de vision du capteur de la caméra. Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.Augmentez la puissance laser à environ 20 milliwatts avant de commencer la séance d’imagerie. Démarrez l’acquisition tomographique en cliquant sur le bouton de démarrage dans le panneau de capture du logiciel d’imagerie, et en même temps commencez à déplacer l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de six micromètres par seconde à l’aide du traducteur motorisé. La combinaison de la méthodologie de clarté avec le TDE comme milieu d’indice de réfraction ne modifie pas de manière significative le volume final de l’échantillon et n’entraîne pas de déformation isotrope de l’échantillon.L’optique d’excitation a produit une feuille de lumière avec un minimum de déchets d’environ six micromètres qui ont divergé jusqu’à 175 micromètres au bord du champ de vision. La synchronisation de l’obturateur roulant de la caméra avec le balayage axial des déchets de la feuille lumineuse a permis de collecter le signal d’émission uniquement dans la partie échantillon excitée par les déchets de la feuille lumineuse, ce qui a donné une moyenne de F W H M d’environ 6,7 micromètres sur tout le champ de vision. La fonction d’étalement du point Z du microscope a également été estimée par une reconstruction tomographique de la nanosphère fluorescente et un F W H M de 6,4 micromètres a été estimé par l’ajustement.La capacité du système à résoudre des membranes cellulaires uniques en trois dimensions avec un rapport signal sur bruit suffisant dans l’ensemble de l’organe a également été confirmée. La procédure de dégazage est l’étape la plus critique du protocole. Si elle n’est pas effectuée correctement, le tissu pourrait subir des dommages indiquant pendant l’incubation dans une solution de nettoyage.Le protocole présenté peut être combiné avec un protocole de coloration multiple pour réaliser une reconstruction d’organe entier intégrant différentes structures biologiques et peut être appliqué à l’étude de modèles pathologiques.

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