Imagerie tomographique simultanée en champ lumineux, en fluorescence et par cohérence optique de trabécules cardiaques contractants ex vivo

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’intégration de trois systèmes d’imagerie dans un seul appareil, ce qui permet une mesure simultanée de la fonction mécanique, de la dynamique ionique et du changement géométrique du tissu cardiaque en contractation. Plus précisément, nous mesurons la production de force du tissu, les transitoires de calcium, les déplacements locaux et le changement de forme. La combinaison de ces modalités d’imagerie peut aider à répondre à des questions clés dans les maladies cardiaques, avec des implications majeures pour le développement de stratégies de traitement efficaces.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier l’hétérogénéité de l’activité musculaire. Le dispositif utilisé dans ce protocole contient trois systèmes d’imagerie capables d’imager le même échantillon, un microscope à champ lumineux, un microscope à fluorescence et un tomographe à cohérence optique. Une série de miroirs dichroïques sont utilisés pour séparer l’émission de fluorescence et l’image de transmission en champ lumineux.

Les caractéristiques fondamentales de cet appareil sont deux crochets de montage actionnés indépendamment, une chambre de mesure avec trois axes optiquement clairs et une ligne de déclenchement externe qui synchronise les caméras en champ clair et OCT avec un stimulateur. Dans cette vidéo, nous montrons comment isoler, préparer et imager les trabécules cardiaques et présentons des résultats représentatifs. Après avoir excisé un cœur d’un rat anesthésié, transférez-le dans la chambre de dissection.

À l’aide de deux pinces incurvées, tirez l’aorte sur la canule de perfusion. Maintenez l’aorte en place avec une pince. Pendant ce temps, ouvrez la ligne de tuyauterie pour permettre à la solution de dissection de s’écouler à travers la canule de perfusion.

Une fois que le système vasculaire coronaire est débarrassé du sang et que le cœur est complètement perfusé avec une solution de dissection, fixez l’aorte en place à l’aide d’une suture. Positionnez le cœur en faisant pivoter la canule de sorte que l’artère coronaire gauche soit visible sur la surface supérieure. Épinglez l’apex du cœur au bas de la chambre de dissection.

Coupez les deux oreillettes. Couper le long du côté droit du septum jusqu’au sommet du cœur. Épinglez le ventricule gauche ouvert à la base de la chambre de dissection.

Ensuite, en coupant le long du côté gauche du septum, ouvrez le ventricule droit et épinglez-le également à la base de la chambre de dissection. Identifier une trabécule libre dans le ventricule droit. À l’aide des ciseaux à ressort et d’une pince, coupez le tissu mural entourant la trabécule.

Ensuite, coupez le tissu de la paroi en deux, orthogonal à la direction de la trabécule. Coupez le tissu mural jusqu’à ce que sa dimension soit adaptée à la configuration de montage utilisée. Laissez la trabécule excisée dans la chambre de dissection.

Rincer l’eau chaude, l’eau distillée, puis la solution de superfusate à travers la chambre de mesure. Allumez la source lumineuse du microscope à champ lumineux et appuyez sur F1 pour activer la capture. Ajustez manuellement le crochet en aval jusqu’à ce qu’il soit centré dans l’image en fond clair.

Cliquez sur zéro axe en aval, puis sur Désactiver en aval pour activer le moteur. Déplacez le curseur de consigne en aval jusqu’à ce que la fin du crochet s’aligne sur le bord de la région d’intérêt par défaut. Remettez à zéro l’axe aval, puis déplacez le curseur de consigne en aval sur 1 000.

Répétez le processus avec le crochet en amont, mais ne déplacez pas le curseur de consigne en amont après avoir mis à zéro l’axe amont. Cliquez sur Déplacer vers le montage. Démarrez le système d’éclairage par fluorescence en basculant l’interrupteur de la lampe avant d’allumer rapidement les sous-systèmes du contrôleur en basculant l’interrupteur principal.

Basculez le mode de fonctionnement sur turbo blanking en appuyant sur le bouton de mode sur le panneau avant, suivi de deux, puis d’un. Appuyez sur le bouton en ligne pour activer le contrôle externe. Mettre en pause l’écoulement du superfusate à travers la chambre de mesure.

Remplissez la chambre de montage avec une solution de dissection. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, transporter le trabécule de la chambre de dissection à la chambre de montage. Laissez les trabécules descendre dans la chambre de montage par gravité.

Abaissez le niveau de fluide dans la chambre de montage afin qu’il soit au niveau de la section médiane des crochets. Ajustez la distance entre les crochets pour refléter la longueur relâchée du trabécule en déplaçant le curseur de consigne en aval. À l’aide d’un microscope pour faciliter la visualisation, saisissez légèrement l’un des morceaux de tissu d’extrémité avec une pince et montez-le sur le crochet en amont.

Montez l’autre morceau de tissu d’extrémité sur le crochet en aval. Une fois solidement monté, déplacez le trabécule dans la chambre de mesure en appuyant sur déplacer vers la chambre et reprenez l’écoulement du superfusate. Réglez la fréquence du stimulus sur un, la durée du stimulus sur 10 et la tension du stimulus sur 10.

Commencez la stimulation en appuyant sur le stimulus. Allumez le système d’éclairage en champ lumineux. Appuyez sur F1 et sélectionnez une région d’intérêt qui entoure une zone striée de l’interface utilisateur.

Cliquez sur calculer la longueur du sarcomère pour calculer la longueur moyenne du sarcomère dans la région en surbrillance. Augmentez la longueur musculaire jusqu’à ce que la longueur moyenne du sarcomère soit d’environ 2,32 microns. Déplacez le muscle en ajustant le curseur de consigne central sur l’onglet de contrôle du centre et de la séparation afin que le bord du crochet en aval soit simplement visible dans l’image en champ clair.

Collectez les informations de fluorescence pour 10 contractions. Augmentez la valeur du point de consigne central de 200 et collectez 10 autres contractions d’informations de fluorescence. Répétez ce processus jusqu’à ce que l’image en champ clair contienne le crochet en amont.

Recueillez la valeur des informations de fluorescence de la fenêtre finale. Remettez la trabécule à une position centrale en définissant la valeur de consigne centrale sur zéro. Réduisez la fréquence de stimulation à 0,2 Hertz et passez du superfusate K-H à la solution de chargement Fura-2.

Mesurez le signal de fluorescence toutes les 10 minutes. Visualisez le signal sur l’onglet signal PMT. Une fois que le signal de 360 nanomètres a été multiplié par 10, ramenez la fréquence de stimulus à un Hertz et revenez à la solution de superfusate K-H.

Vérifiez la mesure du rapport toutes les 10 minutes jusqu’à ce que le signal se stabilise, auquel point la collecte de données peut commencer. Relévez le muscle à la position où le bord du crochet en aval est juste présent dans l’image en champ lumineux. Capturez les informations de fluorescence en cliquant sur Activer la source de fluorescence.

Commencez à diffuser des données matérielles. Sur l’interface utilisateur d’imagerie en champ clair, réglez le mode de capture sur déclencheur externe, augmentez la fréquence d’images à 100 Hertz et définissez le nombre d’images à capturer sur 100. Appuyez sur control-shift-S, suivi de F1, pour enregistrer les données d’imagerie en champ lumineux pour cette fenêtre.

Augmentez la valeur de consigne centrale de 200 et répétez le processus de capture en fond clair. Poursuivez le protocole de numérisation jusqu’à ce que les données d’imagerie aient été collectées pour la fenêtre finale. Remettez la trabécule à une position centrale en définissant la valeur de consigne centrale sur zéro.

Allumez la source d’éclairage de l’OPO en tournant la touche principale, en appuyant sur le bouton d’alimentation, puis sur le bouton SLD. Couvrez la tête du galvanomètre et cliquez sur Obtenir l’arrière-plan pour mesurer le motif d’interférence d’arrière-plan et le soustraire de la mesure. Réglez le mode de capture d’image sur l’affichage en direct.

Centrez la trabécule dans les axes X et Y en ajustant les valeurs de décalage X et Y. Avec la trabécule centrée, balayez le long de l’axe y en ajustant la position Y pour trouver les positions correspondant aux crochets en amont et en aval. Notez ces positions vers le bas.

Définissez la plage Y sur la différence absolue entre ces valeurs divisée par 10. Réglez le mode de capture d’image sur stimulus déclenché, plage X à 100, puis cliquez sur le bouton Définir les paramètres actifs. Cliquez sur les données de flux, puis sur Acquérir.

Afin de capturer les informations régionales sur le calcium et les champs lumineux sur toute la longueur des trabécules présentées ici, sept positions musculaires étaient nécessaires. Ce chiffre de la force moyenne de chacune des positions superposées suggère que la force de contraction n’a pas été perturbée par ce mouvement, révélant qu’il n’y avait pas de dépendance de position de l’acte de production de force. Ces scans collectés à l’aide de la tomographie par cohérence optique à une vitesse de 100 Hertz ont été segmentés à l’aide du plugin ImageJ, Weka.

Chaque section transversale semble déformée en raison de la différence entre les résolutions latérale et de profondeur. Ceci a été corrigé en mettant à l’échelle chaque axe indépendamment avec sa résolution respective. Après avoir détartré le C-scan brut de la trabécule, le muscle est approximativement cylindrique.

Le reflet de la paroi de la chambre de mesure peut parfois se chevaucher avec les données musculaires, mais le logiciel de segmentation peut être entraîné pour en tenir compte. Une fois segmentée, la section transversale le long de la longueur du muscle peut être calculée tout au long de la contraction. Notez que cette trabécule particulière a une petite branche.

Le mouvement de la branche est évident à peu près à mi-chemin le long de la trabécule. Enfin, les images segmentées peuvent être converties en maillages pour faciliter la construction de modèles géométriques. Les données d’imagerie capturées à chacune des sept positions à une vitesse de 100 images par seconde ont été assemblées pour créer une seule image complète de la trabécule.

Le rapport de la fluorescence omise associée à la lumière d’excitation de 340 et 380 nanomètres est corrélé au calcium intracellulaire après que la trabécule a été chargée de Fura-2. La moyenne de 10 transitoires de calcium intracellulaires de chaque fenêtre est alignée avec la région où ils ont été imagés. Alors que le pic des transitoires pour cette trabécule semble raisonnablement cohérent, le calcium diastolique réduit sur toute sa longueur.

De même, les résultats du suivi du déplacement et des calculs de longueur des sarcomères indiquent également la présence d’une variabilité régionale. La technique de suivi sans marqueur utilisée est capable de calculer le déplacement de chaque pixel. La pertinence des estimations de la longueur du sarcomère a été testée en fonction de la largeur et de l’amplitude de l’ajustement gaussien au signal FFT.

Ces conditions n’étaient pas remplies dans la région musculaire entre zéro et 500 microns, de sorte qu’aucune information sur la longueur du sarcomère n’a pu y être calculée. Compte tenu des déplacements associés, il est probable que les sarcomères de cette région se soient allongés pendant la phase contractile de la contraction. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les trabécules cardiaques et de les préparer à l’imagerie multimodale de manière fiable.

Ce processus établit une voie pour la collecte d’un ensemble de données nécessaire à la construction de modèles d’éléments finis physiologiquement informés de la contraction du tissu cardiaque.