Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)

Cette méthode peut aider à résoudre les problèmes avec les méthodes de culture microbienne conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour la culture microbienne automatisée et l’évolution adaptative. Cette technologie automatise les opérations et réduit davantage la consommation de main-d’œuvre.

Et en même temps, il a de bonnes performances culturelles avec des résultats fiables et des opérations simples. La technologie est principalement utilisée dans les domaines de recherche en microbiologie, tels que la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative en laboratoire et une analyse multiniveau à facteur unique. Commencez les préparatifs de l’expérience en connectant l’aiguille de la seringue d’un diamètre intérieur de 0,41 millimètre et d’un diamètre extérieur de 0,71 millimètre à un connecteur rapide A et à un flacon de réactif.

Ensuite, autoclavez tout l’équipement à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour installer la puce microfluidique, ouvrez la porte de la chambre de commande et soulevez la sonde à fibre optique. Après avoir aligné les trous de champ électrique avec les aiguilles, placez doucement la puce sur le piédestal de la puce, puis insérez les deux colonnes de positionnement dans les trous de positionnement et posez la sonde à fibre optique.

Ensuite, connectez le connecteur rapide A de la puce au port correspondant du système de culture de microgouttelettes microbiennes ou MMC en fonction du numéro de position décrit dans le manuscrit. Lorsque vous avez terminé, fermez la porte de la chambre d’opération. Diluer la suspension cultivée d’Escherichia coli MG1655 avec le milieu à une OD600 de 0,05 à 0,1 pour obtenir 10 millilitres de solution bactérienne initiale.

Pour initialiser la console MMC, cliquez sur l’onglet Initialisation. Lorsque l’interface d’initialisation apparaît, réglez la température de culture sur 37 degrés Celsius et la valeur du signal photoélectrique sur 0,6. L’initialisation prendra environ 20 minutes.

Plus tard, placez un flacon de réactif stérilisé sur le banc propre et serrez le bouchon. Utilisez une seringue stérile de 10 millilitres pour injecter trois à cinq millilitres d’huile MMC de l’aiguille de la seringue au tube latéral dans le flacon de réactif. Ensuite, inclinez et faites pivoter lentement le flacon de réactif pour que l’huile s’infiltre complètement dans la paroi interne.

Après avoir injecté cinq millilitres d’une solution bactérienne initiale dans le flacon, remplissez le flacon de réactif en injectant cinq à sept millilitres d’huile MMC. Retirez le connecteur rapide indépendant A du flacon de réactif et insérez le connecteur rapide A dans le connecteur rapide B du flacon pour terminer l’opération d’injection de l’échantillon. Une fois cela fait, ouvrez la porte de la chambre d’opération pour mettre le flacon de réactif dans le bain métallique.

Retirez le connecteur C2 de la puce et le connecteur rapide A de la bouteille de réactif. Connectez le connecteur de tube latéral de la bouteille de réactif au connecteur C2 et le connecteur de tube supérieur au connecteur O2. Fermez ensuite la porte de la chambre d’opération.

Pour choisir la fonction de mesure de la courbe de croissance, cliquez sur Courbe de croissance dans l’interface de paramétrage, entrez le nombre 15. Allumez ensuite le commutateur de détection OD et réglez la longueur d’onde sur 600 nanomètres. Cliquez sur l’onglet Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes.

Le processus prendra 15 minutes. Lorsqu’une fenêtre contextuelle apparaît sur l’interface principale pour demander un message, ouvrez la porte de la chambre de commande pour retirer le flacon de réactif et connecter les connecteurs C2 et O2. Après avoir fermé la porte, cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre contextuelle pour cultiver automatiquement les gouttelettes et détecter les valeurs OD.

Lorsque la courbe de croissance atteint la phase stationnaire, cliquez sur le bouton Exportation de données pour exporter les données OD. Sélectionnez le chemin d’enregistrement des données et exportez la valeur OD enregistrée pendant la période de culture au format CVS Pour tracer la courbe de croissance, utilisez des logiciels de cartographie tels qu’Excel et Origin 9.0. Injecter les volumes requis de la solution bactérienne initiale, du milieu frais et de l’huile MMC dans les flacons de réactif stérilisés séparés pour la solution bactérienne initiale dans le milieu frais, comme expliqué précédemment.

Pour choisir la fonction d’évolution adaptative, cliquez sur ALE dans le logiciel. Dans l’interface de paramétrage, activez le commutateur de détection OD, puis définissez tous les paramètres décrits dans le manuscrit et appuyez sur l’onglet Démarrer pour lancer la génération de gouttelettes. Le processus prendra environ 25 minutes.

Au cours de chaque période de sous-culture, observez si les valeurs maximales de DO des gouttelettes ont augmenté de manière significative. Si l’augmentation se produit et répond aux exigences de l’expérience, cliquez sur le bouton d’exportation des données pour exporter les données OD. Pour extraire les gouttelettes cibles de la console MMC, cliquez sur l’onglet de criblage pour sélectionner la fonction d’extraction des gouttelettes.

Choisissez ensuite l’option Collecter et cliquez sur le nombre de gouttelettes cibles. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur OK. Attendez que la fenêtre contextuelle vous invite à envoyer un message. Ensuite, placez le connecteur rapide CF dans le tube de microcentrifugation pour la collecte et cliquez sur OK. Après une à deux minutes, lorsque l’interface du logiciel affiche une nouvelle fenêtre invitant un message, insérez le connecteur rapide CF et cliquez sur OK pour que MMC continue à fonctionner.

Lorsque la gouttelette cible suivante atteint le site de reconnaissance des gouttelettes, collectez-la comme spécifié précédemment. Utilisez une pipette de 2,5 microlitres pour retirer et placer la gouttelette sur une plaque solide de 90 millimètres, suivie d’étaler la goutte uniformément avec une tige recouverte de verre triangulaire d’une longueur latérale de trois centimètres, puis cultivez la goutte dans un incubateur à température constante de 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Plus tard, choisissez trois à cinq colonies indépendantes de bactéries pour cultiver chaque colonie séparément dans une fiole agitée de 50 millilitres avec 10 millilitres de milieu frais dans un incubateur à agitation à 200 rotations par minute et 37 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures.

Après l’incubation, suivez les réglementations standard connexes pour stocker la solution de bactéries cultivées dans le tube de glycérol. L’analyse représentative montre les courbes de croissance de 50 gouttelettes dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative. Il a été observé que la souche essentielle d’Escherichia coli au méthanol ou MeSV2.2 présentait une croissance initiale lente suivie d’une croissance rapide.

La courbe de croissance de la gouttelette six dans l’ensemble du processus d’évolution adaptative a été tracée séparément. La valeur maximale de l’OD600 dans la première génération était de 0,37, qui est passée à 0,58 au cours de la dernière période de sous-culture, ce qui indique que la souche dans la gouttelette six a réalisé une évolution adaptative évidente. De plus, les courbes de croissance de la souche de gouttelette six et de la souche initiale ont été comparées.

La souche de gouttelette six présentait un taux de croissance spécifique maximal et une concentration cellulaire plus élevés dans la phase stationnaire que la souche initiale. Le plus important est de s’assurer que la connexion de la puce de l’instrument et de la bouteille de réactif est correcte, c’est-à-dire les gouttelettes pour que les opérations se déroulent normalement. Cette méthode fournit aux chercheurs une nouvelle idée pour la culture de micro-organismes et fournit également une plate-forme efficace et peu coûteuse pour l’évolution adaptative des souches.