Name: Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie par tomographie électronique pour visualiser les domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée. Ce protocole utilise le marquage EdU et les particules Nanogold pour cartographier l'ADN néosynthétisé avec une haute résolution.

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Ce travail a été soutenu en partie par RSF (subvention #17-15-01290) et RFBR (subvention #19-015-00273). Les auteurs remercient le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou (PNR 5.13) et le Centre d’excellence Nikon en imagerie corrélative de l’Institut Belozersky de biologie physico-chimique pour leur accès à l’instrumentation d’imagerie.

Le protocole est optimisé pour les cellules adhérentes et a été testé sur les lignées cellulaires HeLa, HT1080 et CHO.
1. Étiquetage et fixation des cellules
<ol><li>Cellules de plaque sur des couvercles nettoyés à l’acide dans une boîte de Petri de 3 cm. Cultiver les cellules dans le milieu recommandé pour la lignée cellulaire utilisée à 70% de confluence.</li>
	<li>Ajouter l’EdU (5-éthyynyl-2'-désoxyuridine) à partir de 10 mM de stock jusqu’à la concentration finale de 10 μM et placer les cellules dans l’incubateur pendant 10 min ou plus (selon l’objectif de l’expérience). Pour des impulsions plus courtes (jusqu’à 2 min), préparez une boîte de Petri avec des milieux de culture frais préchauffés complétés par 10 μM d’EdU et transférez-y des couvercles, plutôt que d’ajouter directement de l’EdU aux cellules. REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante sauf indication contraire.</li>
	<li>Fixer les cellules marquées avec 2,5% de glutaraldéhyde, fraîchement fabriqué en diluant 25% du bouillon dans un tampon cacodylate de 100 mM, pendant 1 h. REMARQUE: Les étapes de détection EdU suivantes sont sensibles au moment de la fixation. Des temps de fixation plus longs peuvent nuire à l’étiquetage EdU, entraînant un rapport signal/bruit plus faible.</li>
	<li>Éliminer le glutaraldéhyde en lavant les échantillons avec du PBS complété par 5 mM MgCl2 (PBS* par la suite). Laver trois fois avec une incubation de 10 minutes pour chaque lavage.</li>
	<li>Perméabiliser les membranes plasmiques avec 1 % de Triton X-100 dans pbS* (PBS*T par la suite). Laver deux fois avec une incubation de 5 minutes pour chaque lavage.</li>
	<li>Lavez abondamment l’échantillon avec PBS*. Effectuez cinq changements et incubez pendant 5 minutes dans chaque changement.</li>
	<li>Trempez les groupes aldéhydes sans résidus avec 20 mM de glycine dans du PBS*, deux fois pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Bloquer les échantillons dans 1% de BSA dans PBS* pendant 30 min.</li>
</ol>2. Cliquez-réaction
REMARQUE : Cette procédure est modifiée à partir d’un protocole19 publié précédemment.
<ol><li>Immédiatement avant utilisation, préparer le mélange Click-reaction pour la détection de l’EdU : dans un tube de microcentrifugation, mélanger 430 μL de 100 mM de Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL de 100 mM CuSO4, 1,2 μL de biotine-azoture (10 mM dans le DMSO) et 50 μL d’acide ascorbique 0,5 M. Pour le contrôle de la qualité de l’étiquetage réplicatif et de la procédure Click au niveau de la microscopie fluorescente, l’azoture de biotine peut être remplacé par l’azoture AlexaFluor 488. REMARQUE: L’ordre d’addition des composants dans la réaction ci-dessus est important.</li>
	<li>Effectuez une réaction par clic dans une chambre humide pour minimiser l’évaporation et les changements de concentration dans le cocktail de réaction. Préparez la chambre humide en plaçant une feuille de papier filtre humide sur le fond de la boîte de Pétri et en la recouvrant d’un film de paraffine. Placez les couvercles sur la surface du film avec les cellules tournées vers le haut et superposez 50 à 100 μL du cocktail de réaction sur le couvercle. La réaction prend 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Arrêtez la réaction en lavant l’échantillon dans 0,1 % de Triton X-100 dans pbS* (PBS*T), cinq fois pendant 5 min chacun.</li>
	<li>Bloquer 1% BSA dans PBS*T pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution de streptavidine-Nanogold avec du PBS*T contenant 1 % de BSA. Incuber l’échantillon avec de la streptavidine, conjuguée avec des particules de Nanogold (Nanosondes) de 1,4 nm dans 1% de BSA + PBS*T pendant la nuit à +4 °C dans la chambre humide nouvellement préparée.</li>
	<li>Arrêtez la réaction et lavez l’échantillon en PBS*T, cinq fois pendant 10 minutes chacun.</li>
	<li>Stabiliser le complexe de biotine streptavidine en post-fixant 1% de glutaraldéhyde dans PBS* pendant 30 min.</li>
	<li>Retirer le glutaraldéhyde par lavage intense à l’eau désionisée et laver l’échantillon dans du PBS*, cinq fois pendant 20 min chacun.</li>
	<li>Trempez les groupes aldéhydes libres avec 1 mg/mL de NaBH4 fraîchement préparé dans de l’eau, deux fois pendant 10 min chacun. Pendant l’incubation, des bulles de H2 se forment qui peuvent soulever les couvercles. Poussez-les soigneusement vers le bas avec la pince à épiler.</li>
	<li>Laver à l’eau désionisée cinq fois pendant 5 minutes chacun. REMARQUE: Pour le contrôle de la qualité à l’étape de l’étiquetage, il est conseillé d’effectuer un étiquetage de contrôle avec de la streptavidine marquée par fluorescence (Figure 2). Cela fournirait une estimation de l’intensité de l’étiquetage et du niveau de fond avant de passer à des étapes ultérieures fastidieuses et sujettes aux artefacts.</li>
</ol>3. Amplification agricole
NOTE : Cette procédure est modifiée à partir de Gilerovitch et coll., 1995 (voir 20,21).
<ol><li>Remettre en suspension 50 g de poudre d’acacia dans 100 mL d’eau désionisée. Dissoudre pendant 3 jours, dégazer et filtrer à travers quatre couches d’étamine. Conserver congelé dans des aliquotes de 5 mL dans des tubes de 50 mL. Décongeler immédiatement avant utilisation.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de 1 M MES (pH = 6,1) à 5 mL d’aliquote décongelée de solution de poudre d’acacia pour obtenir 7 mL de 0,28 M MES (pH = 6,1) dans une solution de poudre d’acacia. Mélanger en berçant lentement le tube pendant 30 min. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.</li>
	<li>Simultanément à l’étape 3.2., laver les couvercles avec tampon de lavage (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM de saccharose), trois fois pendant 10 min chacun.</li>
	<li>Préparer la solution fraîche de gallate de N-propyle (NPG). Dans un tube de 15 mL, dissoudre 10 mg de NPG dans 250 μL d’éthanol à 96 % et ajuster à 5 mL avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Mettez 36 mg de lactate d’argent dans un tube de 15 mL enveloppé de papier d’aluminium.</li>
	<li>Après l’étape 3.2. est terminé, ajouter 1,5 mL de solution de NPG au mélange de poudre d’acacia et à la roche pendant encore 3 min. REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une chambre noire. Utilisez un voyant non actinique (jaune ou rouge).</li>
	<li>Équilibrez l’échantillon avec un tampon de lavage et dirigez-vous vers la pièce sombre. Simultanément, ajouter 5 mL d’eau désionisée au lactate d’argent et dissoudre en agitant vigoureusement pendant 1-2 min.</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL de solution de lactate d’argent au mélange de poudre d’acacia, faire basculer lentement pendant 1 min. Évitez la formation de bulles, car l’oxygène dans le mélange ralentira la réaction.</li>
	<li>Égoutter la solution du plat avec des couvercles et verser 3 mL de mélange de poudre de lactate d’argent et d’acacia sur les cellules. Secouez le plat plusieurs fois et incubez pendant 2-5 min. Le temps d’incubation dépend du lot de poudre d’acacia et de la température. Cela devrait être défini expérimentalement. REMARQUE: Un temps d’incubation plus long peut entraîner une liaison à l’argent non spécifique.</li>
	<li>Pour arrêter la réaction, égouttez le mélange réactionnel et lavez abondamment le plat avec trois à cinq changements d’eau désionisée, suivis de trois autres changements pendant 5 minutes chacun.</li>
	<li>Vérifiez la coloration sous le microscope à fond clair. Une bonne coloration doit être brun clair à brun foncé avec un fond jaunâtre très faible. REMARQUE: Si la coloration ne se développe pas, il est possible de répéter immédiatement avec le mélange déjà fait (le mélange est actif pendant environ 15 minutes s’il est conservé dans l’obscurité). Cependant, la coloration dans ce cas peut se développer trop rapidement.</li>
</ol>4. Tonification de l’or
NOTE: Afin de protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par oxydation OsO4 dans les procédures ultérieures, une imprégnation avec de l’or est utilisée à cette étape (Sawada, Esaki, 1994)22.
<ol><li>Rincer les couvercles à l’eau désionisée.</li>
	<li>Afin de protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par oxydation OsO4 , incuber les échantillons dans de l’acide tétrachloroaurique à 0,05% pendant 2 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver soigneusement à l’eau désionisée pendant 10 min. REMARQUE: À ce stade, un contraste supplémentaire est ajouté au matériau contenant de l’ADN. La couleur de l’échantillon doit passer du brun au noir.</li>
</ol>5. ChromEM
REMARQUE: Ce protocole a été modifié à partir de Ou et al., 201716.
<ol><li>Incuber les couvercles et saturer les échantillons dans 10 μM DRAQ5 dans PBS pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Préparer une solution de tétrachlorhydrate de diaminobenzidine (DAB) à 0,2 % dans 50 mM de Tris ou de PBS : dissoudre le DAB dans 90% du volume final en remuant vigoureusement dans l’obscurité, puis ajuster le pH à 7,0-7,4 avec du NaOH. Réglez le volume à 100% et filtrez à travers un filtre de 0,22 μM, conservez enveloppé dans du papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter la solution DAB aux cellules (2 mL par boîte de Petri de 3 cm) et incuber pendant 1 min.</li>
	<li>Déplacez le couvercle dans la boîte de Petri inférieure en verre et placez-le au stade d’un microscope inversé. Irradier l’échantillon (plusieurs champs de vision) sur un microscope inversé avec source lumineuse aux halogénures métalliques et filtre Cy5 réglé (640 nm, 1 W/cm2 au plan focal) à travers une lentille Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) pendant 10 min. REMARQUE: Une indication de la photoconversion RÉUSSIE du DAB est le photoblanchiment complet du DRAQ5 et la formation de précipités DAB foncés dans les noyaux irradiés. Cependant, ce dernier n’est pas toujours apparent sur un signal EdU-argent-or intense (en particulier lorsque des impulsions EdU étendues sont utilisées).</li>
	<li>Laver à l’eau désionisée trois fois pendant 5 minutes chacun.</li>
</ol>6. Déshydratation et incorporation de résine époxy
<ol><li>Dans un tube de microcentrifugation, préparer une solution partiellement réduite de tétraoxyde d’osmium en mélangeant une solution aqueuse à 2% de K4Fe(CN)6 avec une quantité égale de solution aqueuse à 2% d’OsO4, pour obtenir une concentration finale de 1% des deux composants. Incuber les couvercles dans osO4 réduit pendant 1 h et laver à l’eau désionisée trois fois pendant 5 min chacun. REMARQUE: À ce stade, le composé d’osmium réduit réagit avec les dépôts DAB et augmente le contraste de l’ADN. ATTENTION: L’osmium est toxique, travaille sous une hotte et manipule les déchets conformément aux réglementations de sécurité locales.</li>
	<li>Déshydrater les échantillons dans une série de solutions d’éthanol graduées en pourcentages croissants: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.</li>
	<li>Pour l’infiltration et l’incorporation, utilisez la formule de résine avec le rapport volumétrique des composants comme suit: monomère de résine époxy: DDSA: MNA: DMP-30 = 9: 6: 4: 0,23 (w / w). Cette formule est miscible avec de l’éthanol.<ol>
<li>Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (3 parties 100% EtOH: 1 partie résine époxy) pendant 30 min.</li>
		<li>Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (1 partie 100% EtOH:1 partie résine époxy) pendant 2 h.</li>
		<li>Incuber le couvercle dans le mélange éthanol-résine (1 partie 100% EtOH: 3 parties de résine époxy) pendant la nuit.</li>
		<li>Remplacez le mélange éthanol-résine par de la résine pure fraîchement préparée. Incuber dans un mélange de résine pure pendant 8 h. Ouvrez le plat pour laisser les restes d’éthanol s’évaporer.</li>
		<li>Transférer les couvercles dans un nouveau plat avec de la résine pure et incuber pendant 2 h à 37-42 °C.</li>
		<li>Remplissez un moule en silicium avec de la résine fraîchement préparée. Placez les couvercles avec les cellules tournées vers le bas sur un moule en silicium approprié rempli de résine époxy. Durcir la résine pendant 24 h à 37 °C, puis à 60 °C pendant au moins 2 jours. ATTENTION : Les composants du mélange de résine époxy sont potentiellement cancérigènes. Portez des gants et travaillez sous la hotte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez la dalle de résine du moule, nettoyez la surface du couvercle avec le scalpel ou la lame de rasoir. Pour retirer le couvercle, déposez le couvercle dans de l’azote liquide, puis transférez la dalle dans l’eau bouillante. Répétez l’opération si nécessaire.</li>
	<li>Localisez la zone irradiée sous un stéréomicroscope et découpez-la de la dalle avec une scie à métaux ou tout autre instrument approprié. Préchauffez la dalle à 70 °C sur une plaque chauffante, si nécessaire.</li>
	<li>Fixez la découpe dans un porte-échantillon ultramicrotomique pour le rognage final du bloc. À l’aide du rasoir, préparez l’échantillon en forme de pyramide. Montez le support avec une pyramide sur l’ultramicrotome et installez le couteau.<ol>
<li>Coupez le bloc de sorte que les cellules irradiées portant l’étiquette EdU soient incluses. Préparez une section semi-mince (250 nm d’épaisseur) adaptée à la tomographie électronique. REMARQUE: L’épaisseur de la section peut être ajustée pour répondre aux exigences expérimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détachez la section du bord du couteau et placez-les sur les grilles à fente unique. Pour la tomographie électronique, des sections de 250 nm sont prélevées sur des grilles à fente unique de 1 mm et, après séchage, ces sections peuvent être recouvertes de carbone des deux côtés. Aucun contraste supplémentaire n’est nécessaire. REMARQUE: Étant donné que les sections contiennent déjà des particules Au-Ag à contraste élevé, il n’est pas nécessaire d’ajouter des particules d’or fiduciales à la surface de la section.</li>
	<li>Examinez les grilles dans un microscope électronique à transmission à faible grossissement (environ 600x) pour localiser les cellules avec des modèles de réplication appropriés. REMARQUE: Ce protocole génère une densité d’étiquetage suffisamment élevée pour faciliter la détection des foyers de réplication, même à faible grossissement. Il est conseillé de créer d’abord une carte de la section pour la navigation ultérieure et la collection de projections angulaires pour la tomographie. Passez à un grossissement plus élevé et prenez des images haute résolution.</li>
</ol>7. Tomographie électronique
<ol><li>Insérez la grille dans le microscope électronique à transmission avec un support à haute inclinaison. Chargez l’échantillon dans le microscope électronique et localisez la région d’intérêt.</li>
	<li>Alignez le microscope en mode EFTEM en mode d’éclairage quasi parallèle. Réglez le filtre d’énergie avec une fente de sélection d’énergie de 20 eV placée à un pic de perte zéro.</li>
	<li>Pré-irradier la zone d’acquisition de la tomographie à un débit de dose de 40 e/Å2/s pendant au moins 1,5-2 min, ce qui correspond à la dose totale d’au moins 3000 e/Å2.</li>
	<li>Ajustez la hauteur eucentrique avec une tâche automatique dans SerialEM. Vérifiez la tâche de mise au point automatique pour vous assurer qu’il fonctionne correctement à un angle d’inclinaison nul et à une valeur de mise au point cible de -0,8 mkm.</li>
	<li>Inclinez le porte-échantillon à -60° avec la tâche Walk-Up.</li>
	<li>Configurez l’acquisition de la tomographie de -60 à +60° avec l’étape 2.0°. L’exposition doit être réglée en fonction de l’angle d’inclinaison pour maintenir l’intensité moyenne sur l’appareil photo. Limitez le décalage de l’image au cas où il provoquerait un décalage d’énergie et donc un désalignement de la fente. Les données de tomographie doivent être enregistrées en tant que fichier .mrc.</li>
	<li>Importez le fichier .mrc dans le logiciel IMOD pour la reconstruction de tomographie. Supprimez les valeurs de pixels aberrantes dues aux rayons X.</li>
	<li>Alignez la série d’inclinaison. Effectuez une corrélation croisée initiale, puis marquez manuellement 10 à 12 particules d’or comme fiduciales. Suivez le modèle fiducial et vérifiez que chaque fiducial est suivi correctement à travers la série d’inclinaison. Créez des tomogrammes d’échantillon (tranches) et marquez manuellement les bordures de section minces pour éviter l’inclinaison possible de la densité reconstruite à l’intérieur du volume. L’erreur résiduelle moyenne pour l’alignement fin était inférieure à 1,2 pix.</li>
	<li>Reconstruisez le tomogramme à l’aide d’un algorithme de rétroprojection filtré, puis coupez la sortie pour adapter la région d’intérêt au volume final.</li>
</ol>

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<li>Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+electron+microscopic+immunocytochemistry+with+silver-enhanced+1.4-nm+gold+particles+to+localize+GAD+in+the+cerebellar+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).</li>
<li>Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunogold+labeling+confirms+large-scale+chromatin+folding+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs.</a> Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).</li>
<li>Sawada, H., Esaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nanogold+followed+by+silver+enhancement+and+gold+toning+for+preembedding+immunolocalization+in+osmium-fixed%2C+Epon-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freeze+substitution+fixation-based+gold+enlarging+technique+for+EM+studies+of+endocytosed+Nanogold-labeled+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

La méthode décrite ici présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédemment publiés. Tout d’abord, l’utilisation de la chimie du clic pour le marquage de l’ADN répliqué élimine la nécessité d’une dénaturation de l’ADN préalable à la détection de BrdU avec des anticorps, préservant ainsi mieux l’ultrastructure de la chromatine. 
Deuxièmement, l’utilisation de la biotine comme ligand secondaire généré après la fixation du glutaraldéhyde et la trempe appropriée des groupes aldéhyd...

La réplication de l’ADN est un processus biologique de base requis pour la copie fidèle et la transmission de l’information génétique pendant la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l’ADN est soumise à une régulation spatio-temporelle étroite, qui se manifeste par une activation séquentielle des origines de la réplication1. Les origines de réplication voisines tirant de manière synchrone forment des groupes de replicons2. Au niveau de la microscopie optique, les sites de réplication continue de l’ADN sont détectés comme des foyers de réplication de nombre et de taille variés. Les foyers de réplication présentent des modèles spécifiques de distribution spatiale dans le noyau cellulaire en fonction du moment de la réplication de l’ADN marqué 3,4, qui, à son tour, est étroitement corrélé avec son activité génique. Grâce à une séquence bien définie de réplication de l’ADN, strictement ordonnée dans l’espace et le temps, le marquage réplicatif est une méthode puissante de marquage précis de l’ADN non seulement pour l’étude du processus de réplication en soi, mais aussi pour discriminer une sous-fraction spécifique de l’ADN avec une activité de transcription et un niveau de compactage définis. La visualisation de la chromatine répliquante est généralement réalisée par la détection des principaux composants protéiques de la machinerie de réplication de l’ADN (soit par immunocoloration, soit par expression de marqueurs de protéines fluorescentes 5,6) ou par l’incorporation de précurseurs modifiés de synthèse de l’ADN 7,8,9,10 . Parmi celles-ci, seules les méthodes basées sur l’incorporation de nucléotides modifiés dans l’ADN nouvellement répliqué permettent de capturer les changements conformationnels de la chromatine pendant la réplication et de retracer le comportement des domaines réplicatifs une fois leur réplication terminée.
Chez les eucaryotes supérieurs, l’emballage de l’ADN en chromatine ajoute un autre niveau de complexité à la régulation des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, réparation, etc.). Le repliement de la chromatine affecte l’accessibilité de l’ADN aux transfacteurs régulateurs et aux changements conformationnels de l’ADN (dénouement en double hélice) nécessaires à la synthèse du gabarit. Par conséquent, il est généralement admis que les processus synthétiques dépendants de l’ADN dans le noyau cellulaire nécessitent une transition structurelle de la chromatine de son état condensé et répressif vers une conformation plus accessible et ouverte. Cytologiquement, ces deux états de chromatine sont définis comme l’hétérochromatine et l’euchromatine. Cependant, il n’y a toujours pas de consensus concernant le mode de repliement de l’ADN dans le noyau. Les hypothèses vont d’un modèle de « polymère fondu »11, où la fibre nucléosomique se comporte comme un polymère aléatoire pour lequel la densité d’emballage est contrôlée par des mécanismes de séparation de phase, à des modèles de pliage hiérarchique postulant la formation séquentielle de structures ressemblant à des fibres de chromatine d’épaisseur croissante12,13. Les modèles de repliement hiérarchique ont récemment été soutenus par des approches moléculaires basées sur l’analyse des contacts ADN-ADN in situ (capture de conformation chromosomique, 3C), démontrant l’existence de la hiérarchie des domaines structurels de la chromatine14. Il est important de noter que les unités de réplication sont très bien corrélées à ces domaines de la chromatine15. La principale critique de ces modèles est basée sur l’agrégation potentielle de la chromatine artificielle causée par les procédures de préparation des échantillons, telles que la perméabilisation des membranes cellulaires et l’élimination des composants non chromatines, afin d’améliorer le contraste de la chromatine pour les études ultrastructurales tout en améliorant l’accessibilité de la chromatine pour diverses sondes (par exemple, les anticorps). Les progrès techniques récents dans la coloration sélective de l’ADN pour la microscopie électronique par photo-oxydation de la diaminobenzidine médiée par fluorophore liant l’ADN (ChromEMT6) ont permis d’éliminer cet obstacle. Cependant, les mêmes considérations sont vraies pour la visualisation par microscopie électronique de l’ADNrépliqué 17,18. Nous décrivons ici une technique qui permet la cartographie ultrastructurale simultanée à haute résolution de l’ADN nouvellement synthétisé et de la chromatine totale dans des cellules réticulées au aldéhyde intactes. La technique combine la détection de l’ADN marqué EdU par Click-chemistry avec des sondes biotinylées et streptavidin-Nanogold, et ChromEMT.

<table><tbody><tr><td><réactif fort<>/fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-morpholino)éthane Acide sulfonique (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 555-azide</td><td>Termo Fisher</td><td>A20012</td><td></td></tr><tr><td>biotine-azide</td><td>Lumiprobe</td><td>C3730</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin albumine</td><td>Boval</td><td>LY-0080</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>SPI-CHEM</td><td>26544-38-7</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>SPI-CHEM</td><td>90-72-2</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Scientific</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>Résine époxy monomère</td><td>SPI-CHEM</td><td>90529-77-4</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (25 %, grade EM)</td><td>TED PELLA, INC</td><td>18426</td><td></td></tr><tr><td>Gomme arabique</td><td>ACROS Organics</td><td>258850010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Panreac</td><td>141396.1209</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>SPI-CHEM</td><td>25134-21-8</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Lactate</td><td>d’argent ALDRICH</td><td>359750-5G</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugué</td><td>Termo Fisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Conjugué streptavidine-Nanogold</td><td>Nanosondes</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>acide tétrachloroaurique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1004</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>CHEM-IMPEX INT’L</td><td>298</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka Chemica</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper single slot grids</td><td>Ted Pella</td><td>1GC10H</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 fluorescence set (Ex620/60 DM660 Em700/75)</td><td>Nikon</td><td>Cy5 HQ</td><td>Alternatives : Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Couteau diamanté Ultra Wet 45o</td><td>Diatome</td><td>DU</td><td>Alternatives : Ted Pella</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td>Ti-E</td><td>Alternatives : Zeiss, Leica, Olympus</td></tr><tr><td>Porte-échantillon à inclinaison élevée</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Biosan</td><td>Multi Bio RS-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission fonctionnant à 200 kV en mode EFTEM, avec goniomètre à haute inclinaison</td><td>Jeol</td><td>JEM-2100</td><td>Alternatives : FEI, Hitachi</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Ted Pella</td><td>523</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>UltraCut-E</td><td>Alternatives : RMC</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition d’images</td><td>Open Source</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)</td><td></td></tr><tr><td>Traitement d’images</td><td>Open Source</td><td>IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Les principes du repliement de l’ADN dans le noyau cellulaire et ses transformations dynamiques qui se produisent lors de l’accomplissement des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, ségrégation, etc.) restent mal compris, en partie en raison du manque d’approches expérimentales de visualisation à haute résolution de loci de chromatine spécifiques dans des noyaux structurellement préservés. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation des domaines réplicatifs dans la culture cellulaire monocouche in situ, en combinant le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé avec la détection ultérieure du marquage avec l’amplification Ag des particules Nanogold et la coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole permet l’étiquetage pré-intégration à contraste élevé et à haute efficacité, compatible avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui offre la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement des échantillons à température ambiante. Un autre avantage de l’étiquetage de pré-intégration est la possibilité de présélectionner les cellules d’intérêt pour la section. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de populations cellulaires hétérogènes, ainsi que pour la compatibilité avec les approches de tomographie électronique pour l’analyse 3D à haute résolution de l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, et l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine et de la ségrégation des chromatides sœurs dans l’interphase.

Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles distincts de distribution dans le noyau en fonction de la progression de la phase S. Ces modèles sont en corrélation avec l’activité transcriptionnelle des loci en cours de réplication. Étant donné que la méthode présentée ici utilise une procédure de fixation assez forte, il est assez simple d’utiliser le marquage d’impulsions réplicatives pour la détection spécifique de loci de chromatine dans divers états transcriptionnels, même...

Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.

Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Nous présentons un protocole pour la visualisation microscopique électronique des domaines réplicatifs dans la cellule par le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé et la détection d’étiquettes avec amélioration de l’argent des particules Nanogold et coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole donne l’étiquetage de pré-intégration à contraste élevé avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui donne la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement de l’échantillon à température ambiante. Ce protocole est optimisé pour la cellule d’adhérence qui se développe sur les couvercles de la boîte de Pétri.Ajouter EdU à la concentration finale de 10 micro-moles et placer les cellules dans l’incubateur pendant le temps de marquage souhaité. Fixez les cellules marquées avec 2,5% de gluaradehydrate dans une solution de cacodylate de sodium de 100 millimoles pendant une heure. Un temps de fixation plus long peut nuire à l’étiquetage EdU.Éliminer le glutaraldéhyde en rinçant les échantillons avec du PBS complété par cinq millimoles de chlorure de magnésium, considéré comme une étoile PBS. Laver trois fois pendant 10 minutes. Perméabiliser les membranes plasmiques avec une solution à 1% de Trione X-100 dans l’étoile PBS, effectuer deux changements pendant cinq minutes chacun.Cette solution est en outre appelée étoile PBS T.Lavez abondamment l’échantillon avec une étoile PBS. Cinq changements pendant cinq minutes chacun. Éteignez les groupes aldéhydes résiduels avec 20 millimoles de glycine dans l’étoile PBS, deux fois pendant 10 minutes.Placez l’échantillon dans l’étoile PBS avec 1% BSA pendant une demi-heure. Pendant le blocage dans BSA, préparez le cocktail de réaction pour la détection EdU. L’ordre d’ajout des composants est important.La conjugaison biotine-azoture EdU est effectuée dans la chambre humide pour minimiser l’évaporation et les changements de concentration dans le cocktail réactionnel. Préparez la chambre humide. Placez le couvercle sur le parafilm avec une cellule tournée vers le haut et superposez 50 à 100 microlitres du cocktail de réaction sur le couvercle.La réaction prend 30 minutes à température ambiante. Arrêtez la réaction en lavant l’échantillon dans l’étoile PBS T, cinq fois pendant cinq minutes chacun. Bloquez à nouveau avec 1% BSA dans l’étoile PBS T pendant une autre demi-heure.Préparer la solution de streptavidine-Nanogold dans PBS star T avec 1% de BSA. Incuber l’échantillon avec de la streptavidine pendant la nuit à plus quatre degrés dans une chambre humide nouvellement préparée. La procédure est la même qu’avec la conjugaison biotine-azoture EdU.Arrêtez la réaction et lavez l’échantillon, cinq fois pendant 10 minutes chacun avec l’étoile PBS T.Stabiliser le complexe de biotine streptavidine par fixation supplémentaire va 1% glutaraldéhyde PBS étoile pendant une demi-heure. Éliminer le glutaraldéhyde par lavage intense à l’eau désionisée. Éteindre les groupes aldéhydes résiduels avec un milligramme par millilitre de borohydrure de sodium.Laver à nouveau soigneusement. La prochaine étape consiste à augmenter la taille des particules de Nanogold au moyen d’un dépôt d’argent sur le parcours d’or. Préparez des prémélanges pour minimiser l’activité de la chambre noire.Équilibrez les échantillons avec un tampon de lavage et passez à une chambre noire. Dans la chambre noire, mélangez les composants pour préparer la solution de lavage et appliquez-la sur les échantillons. La solution de poudre d’acacia est hautement visiculaire.Ainsi, lors du mélange des composants, faites basculer le tube lentement pour éviter la formation de bulles et de mousse. La réaction prend de deux à cinq minutes. Nous vous recommandons d’effectuer un test pour déterminer le temps de réaction optimal.Un temps d’incubation plus long peut entraîner un dépôt d’argent non spécifique. Pour arrêter la réaction, rincez rapidement l’échantillon avec trois à cinq changements de l’eau désionisée. Suivi de trois autres changements pendant cinq minutes chacun.Pour protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par le tétroxyde d’osmium, incuber les échantillons dans de l’acide tétrachloroaurique à 0,05% pendant deux minutes dans l’obscurité. Laver soigneusement à l’eau désionisée. À ce stade, un contraste supplémentaire est ajouté au matériau contenant de l’ADN.Saturer l’échantillon avec une coloration d’ADN DRAQ5. Ajouter la solution de diamionobenzidine à l’échantillon et incuber pendant une minute. Déplacez le couvercle dans la boîte de Petri inférieure en verre et placez-le sur la scène du microscope inversé.Irradier plusieurs champs de vision avec une lumière rouge de 640 nanomètres. Le panneau de gauche montre le blanchiment photo complet de DRAQ5. Sur le panneau de droite, le même champ de vision est imagé dans la lumière transmise montrant le précipité DAB.Laver les échantillons avec de l’eau désionisée. L’étape suivante doit être effectuée sous la hotte. Préparation d’une solution de tétroxyde d’osmium partiellement réduite.Fais attention. Cette substance est très volatile et toxique. Appliquer la solution préparée sur l’échantillon.À ce stade, les composés d’osmium réduits réagissent avec les dépôts de diamionobenzidine et augmentent le contraste de l’ADN. Éliminez la solution contenant de l’osmium conformément à votre réglementation locale et lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun. L’échantillon est ensuite déshydraté dans une série de concentrations croissantes d’éthanol suivies de l’infiltration des cellules avec des mélanges de résine d’éthanol.Remplacez le mélange de résine d’alcool par de la résine pure fraîchement préparée. Remplissez le moule d’encastrement de taille appropriée avec une résine fraîchement préparée. Placez le couvercle avec une cellule tournée vers le bas au-dessus de la cavité remplie de résine.Durcir la résine pendant 24 heures à 37 degrés. Puis à 60 degrés pendant au moins deux jours. Retirez la résine d’une surface inférieure d’un couvercle.Déposer la dalle dans un azote liquide, puis transférer dans de l’eau bouillante. Le verre doit se détacher. Répétez l’opération si nécessaire.Les champs de vision irradiés doivent être clairement visibles en raison du dépôt de diamionobenzidine et de la coloration DAB. Découpez la zone d’intérêt de la dalle à l’aide de la scie à métaux ou de tout autre instrument approprié. Placez la découpe dans le support simple ultramicrotome.Configurez l’ultramicrotome pour le rognage final du bloc. À l’aide de la lame de rasoir, préparez le pilulier en forme de pyramide. La taille d’une zone plate au sommet de la pyramide devrait être d’environ 400 par 200 microns.Montez la pyramide préparée dans le bras ultramicrotome et installez le couteau. Préparez les sections. L’épaisseur de la section peut être ajustée pour répondre aux exigences expérimentales.Nous visons la tomographie EM. Nous avons donc préparé des sections d’une épaisseur de 250 nanomètres, également appelées sections semi-minces. Détachez les sections du bord du couteau et montez-les sur une grille de fente.Nous avons utilisé une grille de fentes, elles étaient rondes d’un millimètre pour être autour, une ouverture latérale d’un millimètre. La petite taille d’ouverture offre une meilleure stabilité des sections. Laissez les échantillons sécher sur la grille.En ce moment, les sections sont prêtes pour l’observation. Placez la grille dans le porte-échantillon du microscope électronique. Chargez l’échantillon dans le microscope électronique.Acquérir la série tilt. Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles de distribution distincts en fonction de la progression de la phase S. Le marquage réussi de l’EdU confirmé par la réaction de clic avec de l’azoture marqué par fluorescence démontre un schéma de réplication typique dans la population cellulaire hétérogène après fixation du glutaraldéhyde sur le dessus.Le marquage de la streptavidine peut être influencé par le glutaraldéhyde. Vérifiez donc d’abord la coloration à la streptavidine de fluorescence dans les mêmes conditions que la streptavidine nanogold sur le fond. Le bon résultat de la procédure d’amélioration de l’argent est une coloration brun foncé de certains noyaux et une tache de cytoplaste jaune très faible, montrée sur le fond.L’avantage d’un étiquetage de pré-intégration est la possibilité de sélectionner des cellules pour le sectionnement. C’est possible à ce stade car les motifs d’étiquetage deviennent visibles sous un microscope à champ lumineux. L’étiquetage approprié permet d’obtenir les sites de réplication bien délimités.Arrowhead montre les fibres de chromatine colorées DAB. L’étiquetage de fond à droite est limité à quelques nanoparticules par micron carré. Les sections semi-minces sont prêtes pour la tomographie et ne nécessitent pas l’ajout de nanoparticules d’or.L’approche décrite utilisée pour les études de l’organisation de la chromatine sur des sites avec réplication activée. Pour l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine, y compris l’imagerie à haute résolution de la ségrégation de la chromatine. Il est également utilisé pour le marquage répliqué de grands domaines chromosomiques et les études du repliement de la chromatine d’ordre supérieur et de l’hétérochromatine.Cette technique d’imagerie est également importante comme point de référence pour les données générées par d’autres approches non microscopiques. La méthode peut également être intégrée dans des études microscopiques corrélées, y compris des techniques de super résolution. Cela ouvre de nouveaux horizons dans l’étude de la structure d’ordre supérieur de la chromatine et de sa dynamique dans les différents états physiologiques de la cellule.

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