Formulation et modulation acoustique de nanogouttelettes de perfluorocarbone vaporisées optiquement

Ce protocole permet une synthèse simple et rapide de nanogouttelettes de perfluorocarbone vaporisées optiquement et fournit une méthode pour améliorer les performances de ces particules. La version Personne permet d’améliorer le contraste en manipulant simplement la phase de l’imagerie échographique en premier. Il ne nécessite aucun équipement supplémentaire et peut être effectué sur n’importe quel système à ultrasons programmable.

Commencez par rincer une fiole à fond rond de 10 millilitres avec du chloroforme et lavez une seringue en verre étanche au gaz de 10 microlitres et d’un millilitre avec du chloroforme en aspirant à plusieurs reprises le volume complet de la seringue et en l’expulsant trois fois au total. À l’aide des seringues, ajouter 200 microlitres de 25 milligrammes par millilitre DSPE-mPEG-2000, huit microlitres de 10 milligrammes par millilitre DSPC et un millilitre d’un milligramme par millilitre IR-1048 dans la fiole à fond rond. N’oubliez pas de nettoyer les seringues entre les lipides ou les colorants pour éviter toute contamination du stock.

Retirez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif. Assurez-vous que le vide est lentement ajusté à 332 millibars pour éviter les chocs. Après cinq minutes, réduisez la pression à 42 millibars pour éliminer toute eau qui aurait pu pénétrer dans la solution.

Suspendre le gâteau lipidique dans un millilitre de PBS et soniquer ou vortex à température ambiante pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que tout le gâteau lipidique ait été suspendu et dissous dans la solution. Transférer la solution dans un flacon en verre de sept millilitres et placer le flacon dans un plat en verre rempli de glace pour permettre à la solution de refroidir pendant cinq minutes. Rincer une seringue en verre étanche aux gaz avec du perfluorohexane.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de perfluorohexane au flacon à l’aide de la seringue. Sondez le mélange avec l’amplitude réglée sur un, le temps de traitement réglé sur 20 secondes, l’impulsion sur le réglage sur une seconde et l’impulsion éteinte réglée sur cinq secondes. Ensuite, modifiez les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte et soniquez le mélange une fois de plus.

Transférer la solution de nanogouttelettes dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre et centrifuger à 300 g pendant trois minutes pour séparer les plus grosses gouttelettes qui mesurent plus d’un micromètre des plus petites gouttelettes. Jetez la pastille et transférez le surnageant dans un autre tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Laver le surnageant par centrifugation à 3 000 g pendant cinq minutes pour enduire toutes les gouttelettes de la solution.

Re-suspendre les PFCnDs dans un millilitre de PBS en pipetant la pastille de haut en bas, puis sonicer dans un sonicater de bain pendant une minute. Diluer le stock de PFCnDs 100 fois en ajoutant 10 microlitres de PFCnD stock à 990 microlitres de PBS et de sonicate de bain pour disperser les PFCnD avant de mesurer leur taille. Mesurez la taille des gouttelettes à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière.

Dégazer l’eau en remplissant un ballon sous vide de 500 millilitres avec 400 millilitres d’eau désionisée, sceller avec un bouchon en caoutchouc et connecter le ballon à la conduite de vide. Ouvrez la conduite de vide et immergez le fond de la fiole dans le sonique du bain. Sonicate pendant cinq minutes ou jusqu’à ce qu’aucune formation de bulles de gaz ne soit visible.

Préparer 10% d’ammonium par solution de sulfate en dissolvant 500 milligrammes dans cinq millilitres d’eau dégazée. Remuer doucement la solution si le persulfate d’ammonium ne se dissout pas complètement. Dans un bécher de 400 millilitres avec une barre d’agitation sur une plaque d’agitation, ajouter 150 millilitres d’eau dégazée et 50 millilitres de solution de bisacrylamide 40 acrylamide pour former 200 millilitres de solution de bisacrylamide à 10%.

Remuer le mélange à 200 RPM pour permettre un mélange correct sans introduire de bulles. Peser 400 milligrammes de silice et l’ajouter à la solution de bisacrylamide à 10% pour former une solution à 0,2% de silice et d’acrylamide. Préparez un moule carré avec une inclusion cylindrique en coupant les pointes d’une pipette de transfert en plastique et en le soutenant dans le moule avec du ruban de laboratoire.

Ajouter deux millilitres de solution de persulfate d’ammonium à 10% dans le bécher pour obtenir une concentration finale de 0,1% et ajouter 250 microlitres de TEMED à la solution fantôme. Laissez la solution remuer pendant moins d’une minute. Versez rapidement la solution dans le moule tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air dans la solution.

La solution doit polymériser dans les 10 minutes. Retirez le fantôme en faisant passer l’extrémité plate d’une spatule de laboratoire autour du bord du moule et en inversant le moule. Allumez et réchauffez le système laser pulsé pendant environ 20 minutes en suivant les instructions du fabricant.

Assurez-vous que le faisceau de fibres optiques est correctement connecté à la sortie laser et que les deux pieds sont correctement placés dans le support du faisceau de fibres. Après avoir allumé le système d’imagerie par ultrasons, connectez le transducteur d’imagerie matricielle au système et fixez le transducteur dans le support pour aligner son plan d’imagerie avec la section transversale laser. Réglez la fréquence de répétition des impulsions du système laser à 10 hertz et placez un capteur de puissance à l’extrémité du faisceau de fibres pour mesurer l’énergie.

Réglez le délai de commutation Q jusqu’à ce que la fluence estimée soit de 70 milijoules par centimètre carré. Remplissez l’un des canaux du fantôme de polyacrylamide avec le gel à ultrasons et le mélange PFCnD à l’aide d’une seringue à embout coulissant en plastique d’un millilitre. Couvrez généreusement le haut du canal avec du gel à ultrasons et retirez les bulles avec une seringue à embout coulissant en plastique d’un millilitre.

Enfin, placez le fantôme de polyacrylamide sous le transducteur et le faisceau de fibres. La formulation réussie et la séparation centrifuge des PFCnDs donnent des gouttelettes d’environ 200 à 300 nanomètres de diamètre. La taille des gouttelettes augmente avec le temps en raison de la coalescence et de la diffusion dans un processus connu sous le nom de maturation d’Ostwald.

Le contraste par rapport à l’inclusion pour l’impulsion finale s’est avéré être environ 3,2 fois plus grand, soit une amélioration de 220% par rapport à l’impulsion P. La zone hyperéchogène a été calculée pour chaque image et normalisée par la zone hyperéchogène de la première image, puis ajustée à un modèle de décroissance exponentielle. Le temps de désintégration caractéristique de la zone hyperéchogène normalisée était jusqu’à 3,5 fois plus long en imagerie par impulsions N par rapport à l’impulsion P.

Les images différentielles en mode B ont été enregistrées à temps pour chaque imagerie à impulsions N et à impulsions P. L’une des choses les plus importantes est d’expulser les lipides au fond du flacon pour s’assurer qu’ils sont correctement incorporés dans le gâteau lipidique.