Ablations volumiques profondes et spatialement contrôlées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la Gastrula du poisson-zèbre

Dans les embryons, les cellules interagissent les unes avec les autres, échangeant des informations chimiques et mécaniques. Un moyen efficace de sonder ces interactions est de tuer certaines cellules et de surveiller les conséquences sur les cellules voisines. La méthode que nous décrivons nous permet d’ablation précise des cellules, même à l’intérieur de l’embryon, sans endommager les tissus voisins.

Préparez le microscope à deux photons en réglant le premier laser sur la longueur d’onde d’ablation de 820 nanomètres et le second sur la longueur d’onde d’imagerie mCherry de 1 160 nanomètres. À l’aide de miroirs mobiles sur le chemin optique, alignez les deux faisceaux laser à l’entrée et à la sortie des têtes de balayage, puis mesurez la puissance maximale du premier laser à 820 nanomètres. Placez le capteur de puissance sous l’objectif, fermez la chambre noire et réglez la première puissance laser sur 100% Démarrer la collecte de données sur le capteur de puissance, ouvrez l’obturateur laser, puis mesurez la puissance de sortie et calculez le pourcentage de puissance laser nécessaire pour atteindre 300 milliwatts.

Réglez le premier laser sur la longueur d’onde d’excitation GFP de 920 nanomètres et la puissance sur 7% Ajustez la deuxième puissance laser à 15%Activez les détecteurs PMT pour les lignes vertes et rouges, et réglez la sensibilité PMT des lignes vertes et rouges sur 65. Ajustez le champ de vision à 400 x 400 micromètres, la résolution de l’image à 512 x 512 pixels et la fréquence de numérisation à 800 hertz. Sélectionnez le mode d’imagerie en accéléré 3D, puis créez un dossier et activez l’enregistrement automatique pour enregistrer les données après chaque acquisition.

Assemblez la chambre de chauffage et réglez-la à 28 degrés Celsius. Attendez au moins 10 minutes pour que la chambre et l’objectif se réchauffent. Sous un stéréomicroscope à fluorescence, identifier les embryons à 70% d’épiboly qui expriment la GFP.

À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, il faut transférer trois à quatre embryons sélectionnés dans le plat enrobé d’agarose et les décéchorioner soigneusement avec une pince fine. Dans un petit flacon en verre, ajouter un millilitre d’une solution de milieu embryonnaire pénicilline-streptomycine contenant 2% d’agarose et placer le flacon dans un bloc chauffant préchauffé et sec à 42 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette en verre poli au feu, transférez un embryon déschorioné dans le flacon, en prenant soin de ne pas ajouter trop de milieu embryonnaire à l’agarose.

Jeter le milieu embryonnaire restant de la pipette. Aspirez l’embryon en arrière, avec suffisamment d’agarose pour couvrir la glissière du plat inférieur en verre. Soufflez l’agarose avec l’embryon sur la lame de verre du plat, en vous assurant que l’embryon ne touche pas l’air ou le côté plastique du plat.

Ensuite, remplissez la chambre autour de la glissière de verre avec de l’agarose. À l’aide d’un cil, orientez l’embryon de manière à ce que la région ciblée soit au sommet. Après cinq minutes, lorsque l’agarose est complètement fixée, ajoutez quelques gouttes de milieu embryonnaire pénicilline-streptomycine à la lame de verre.

Placez le plat inférieur en verre sous l’objectif dans la chambre chauffée. Immerger l’objectif dans un milieu embryonnaire pénicilline-streptomycine avant de fermer la chambre. Déplacez le curseur pour définir le trajet de la lumière sur les oculaires.

Allumez la lampe à fluorescence. Trouvez un embryon et mettez le focus sur sa surface. Éteignez la lampe à fluorescence et réglez le trajet de la lumière vers les PMT avant de fermer la chambre noire.

Commencez l’imagerie en direct et localisez le mésoderme axial. Pour avoir un bon signal, ajustez les puissances du laser. Utilisez le canal rouge pour déplacer la scène tout en haut de l’embryon et attribuez cette position comme Z est égal à zéro.

Choisissez un pas de temps d’une minute et un pas Z de deux micromètres. Placez la première tranche à 15 micromètres au-dessus du mésoderme axial et la dernière tranche à 15 micromètres au-dessous du mésoderme axial. Enregistrez 10 à 15 minutes d’un film pré-ablation.

Lors de l’imagerie en direct, localisez le contour du polster, puis, à l’aide de la région d’intérêt du modulateur électro-optique ou de l’outil EOM-ROI, dessinez un rectangle de 20 pixels de large qui s’étend sur toute la largeur du polster et placez le rectangle au milieu du polster. Notez la position axiale des plans les plus hauts et les plus bas à ablation, en veillant à ce que le retour sur investissement ne chevauche pas la cellule jaune sur aucun des plans. Placez la scène à la position Z la plus basse à abléser.

Réglez la première longueur d’onde laser sur 820 nanomètres et entrez le pourcentage de puissance calculé précédemment pour obtenir une puissance de sortie de 300 milliwatts. Réglez la fréquence d’imagerie sur 200 hertz et la première moe d’image laser sur zéro. Après avoir sélectionné le mode ROI Treat, désactivez la moE et configurez le traitement pour qu’il démarre immédiatement après zéro image.

Placez le mode d’imagerie sur Timelapse et désactivez l’enregistrement automatique. Après avoir sélectionné le mode Rapide dans l’étape De temps, ajustez le nombre d’images de traitement et le nombre d’images à la valeur correspondant à la profondeur ciblée. Commencez l’imagerie.

L’acquisition doit être noire, car l’obturateur de PMT se ferme pendant le traitement EOM. Ensuite, montez sur la scène jusqu’à la position Z suivante et effectuez de la même manière l’ablation. Répétez sur chaque position Z jusqu’à ce que le sommet du polster soit atteint.

Lorsque le processus d’ablation est terminé, réglez le premier laser sur 920 nanomètres et ajustez-le à la puissance d’imagerie précédemment choisie. Mettez la première MOE d’imagerie laser à 100 et optez pour le mode Plein champ. La fréquence d’imagerie doit être de 800 hertz et la moE doit être désactivée avant d’examiner l’ensemble de la pile en mode actif pour vérifier si chaque plan a été ablation.

Une fois l’ablation confirmée, sélectionnez 3D Time lapse comme mode d’imagerie. Réactivez l’enregistrement automatique et commencez à enregistrer le film post-ablation pendant 40 à 60 minutes. Dans le film post-ablation, vérifiez si les cellules ciblées ont été effectivement ablées.

Comme les ablations à travers les polsters ne devraient pas nuire aux embryons, la morphologie normale des embryons ablés peut être observée jusqu’à 24 heures après la fécondation. Dans le résultat positif des ablations au laser, les tissus superposés n’ont pas été affectés par l’ablation des structures sous-jacentes. Un traitement trop intense, ou trop peu de traitement, a entraîné des échecs dans l’ablation au laser.

Un exemple d’ablation infructueuse montre des cellules au-dessus du polster en train d’être ablées, ce qui était évident par des débris autofluorescents dans le plan focal au-dessus du polster. Dans une autre tentative inefficace, les cellules ont été blanchies mais pas ablées, et les signaux de faible fluorescence révèlent toujours les contours cellulaires intacts. Enfin, certaines cellules n’ont même pas été blanchies en raison d’un traitement au laser insuffisant.

La formation de bulles est due à une cavitation induite par un traitement laser trop intense. Les piles Z ont été capturées toutes les minutes pendant 40 minutes lors d’une ablation réussie, enregistrant à la fois les signaux GFP cytoplasmiques et les signaux nucléaires mCherry. De plus, les noyaux appartenant à la moitié antérieure du polster sont marqués d’un point magenta et suivis dans le temps, avant et après l’ablation.

Comme mesure de la persistance de la migration, l’auto-corrélation de direction des cellules avant et après l’ablation a été étudiée. Les cellules appartenant à la partie antérieure du polster présentaient un mouvement persistant avant l’ablation, qui diminue considérablement après l’ablation, indiquant une perte de migration collective orientée. Il est essentiel d’aligner correctement les lasers et de mesurer la puissance du laser pour obtenir des résultats reproductibles.

Il est également essentiel de vérifier l’efficacité de l’ablation sur les premières images post-ablation. Nous utilisons des ablations au laser pour interroger le rôle des interactions cellule-cellule dans le guidage de la migration des cellules au sein de l’embryon. Mais la procédure pourrait être facilement adaptée à de nombreuses autres questions où les cellules ou les tissus doivent être ablations avec précision, potentiellement profondément dans l’organisme.