Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120
19 août 2021
L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.
Ce protocole est important car il s’agit d’une méthode optogénétique, ou activée par la lumière, pour induire l’expression des gènes, dans un organisme intact. Dans notre cas, un embryon de poisson zèbre. L’avantage de cette technique, c’est qu’elle utilise la lumière, comme agent inducteur, ce qui permet un contrôle très précis, spatial et temporel de l’induction.
Ce protocole serait utile pour toute situation où l’expression génique inductible serait utile. Cela inclut des choses comme le traçage de la lignée, les tests de gain de fonction ou les expériences de sauvetage. Pour commencer, positionnez le panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons pour délivrer 1,5 milliwatts par centimètre carré de puissance de lumière à plusieurs embryons à la fois.
Pour réduire le risque d’endommagement photo de l’activateur transcriptionnel de la queue, affichez la lumière à des intervalles d’une heure à l’aide d’un relais de minuterie, si elle s’allume pendant plus de trois heures. Retirez les couvercles des boîtes de Petri pour minimiser la diffusion de la lumière due à la condensation. Placez des boîtes de Petri contenant des embryons témoins et une boîte à l’épreuve de la lumière pour les témoins sombres.
Retirez les embryons de l’éclairage, après la durée d’activation souhaitée. Pour l’extraction totale de l’ARN, utilisez un kit d’extraction d’ARN. Transférer les embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et éliminer l’excès d’eau d’œuf.
Après avoir ajouté un tampon de lyse, homogénéiser les embryons avec le pilon en plastique. Transférez le lysate dans une colonne fournie par le kit et suivez les instructions du fabricant pour purifier l’ARN. Conservez l’ARN purifié, à moins 20 à moins 80 degrés Celsius, jusqu’à l’utilisation ou synthétisez immédiatement l’ADNc à partir d’un microgramme, l’ARN total à l’aide du kit de synthèse de l’ADNc, en suivant les instructions du fabricant.
Ajouter un microgramme d’ARN dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 millilitre, contenant quatre microlitres, de cinq fois le mélange maître de la réaction d’ADNc, suivi de l’ajout d’un microlitre, de 20 fois la solution enzymatique de transcriptase inverse. Ensuite, composez un volume final de 20 microlitres, avec de l’eau sans nucléase. Placez le tube dans un thermocycleur programmé pour la synthèse de l’ADNc.
Conserver l’ADNc synthétisé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation ou utilisation immédiate pour l’évaluation quantitative. Mettre en place les réactions PCR quantitatives contenant le mélange maître d’enzymes cyber-vertes. Cinq fois dilués d’ADNc et de GFP à une concentration de 325 nanomolaires dans des triplicates et conduisent la réaction dans une machine pcR programmée en temps réel.
À la fin de la réaction, analysez la courbe de fusion pour déterminer la spécificité de la réaction. Calculez l’induction activée par la lumière lorsque le pli change par rapport aux embryons témoins à l’aide de la méthode de double TD Delta. Et utilisez un logiciel statistique pour déterminer la signification.
Après avoir retiré les embryons de l’éclairage, immobiliser les embryons pour l’imagerie dans 3% de méthylcellulose contenant 0,01% de tricaïne dans des lames de dépression en verre. Obtenez des images de fluorescence et de champ lumineux sur un stéréomicroscope fluorescent connecté à un appareil photo numérique à l’aide des paramètres de filtre GFP standard. Fusionnez les images en champ clair et en fluorescence après l’acquisition avec un logiciel de traitement d’image.
La quantification de l’expression de la GFP a indiqué l’induction de l’expression dès 30 minutes après l’exposition à la lumière bleue. Les niveaux d’expression de GFP ont ensuite continué à augmenter jusqu’à six heures, après l’activation régulièrement. L’induction de GFP a également été évaluée qualitativement en examinant l’intensité de fluorescence aux mêmes points de temps après l’activation.
La fluorescence GFP au-dessus des niveaux de fond a été observée pour la première fois trois heures après l’activation et est devenue nettement plus brillante six heures après l’activation. En revanche, les embryons de contrôle pour tous les points temporels, maintenus dans l’obscurité, ne présentaient pas de fluorescence GFP appréciable. La lumière d’activation doit être dans la gamme bleue du spectre de la lumière visible.
La lumière de la pièce et la lumière du soleil contiennent de la lumière bleue. Prenez donc soin de protéger vos contrôles négatifs de toute source de lumière ambiante. Le système TAEL C120 est génétiquement codé et modulaire et peut conduire l’expression de n’importe quel gène d’intérêt.
Ainsi, combiné avec d’autres techniques, il peut être utilisé pour répondre à une gamme de questions biologiques.
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Aperçu
Ce protocole démontre l'utilisation de l'optogénétique pour obtenir une expression génique inductible par la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue permet un contrôle précis de l'expression génique dans un organisme intact.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Optogénétique
- Expression génique
- Modèles de poisson-zèbre
Contexte
- L'optogénétique est une méthode activée par la lumière pour induire l'expression génique.
- Cette technique fournit un contrôle spatial et temporel de l'induction.
- Elle est particulièrement utile pour le traçage de lignée et les tests de gain de fonction.
- Les embryons de poisson-zèbre servent de modèle pour étudier l'expression génique in vivo.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode d'expression génique inductible par la lumière.
- Fournir un protocole pour les chercheurs intéressés par les applications optogénétiques.
- Faciliter les expériences nécessitant un contrôle précis de l'expression génique.
Méthodes utilisées
- Positionnement d'un panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons.
- Livraison de 1,5 milliwatt par centimètre carré de lumière.
- Induction de l'expression génique dans plusieurs embryons simultanément.
- Utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour le contrôle des gènes.
Résultats principaux
- Induction réussie de l'expression génique chez les embryons de poisson-zèbre.
- Contrôle spatial et temporel démontré sur l'activation des gènes.
- Fourni un protocole fiable pour les futures études optogénétiques.
- Mis en évidence les avantages de l'utilisation de la lumière comme agent inducteur.
Conclusions
- L'optogénétique offre un outil puissant pour étudier la fonction des gènes.
- Le système TAEL/C120 est efficace pour induire l'expression génique in vivo.
- Cette méthode peut être appliquée à divers scénarios de recherche biologique.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
