Contrôles d’antigènes synthétiques pour l’immunohistochimie

Les gels antigéniques BSA sont des normes IHC reproductibles bien caractérisées qui peuvent compléter les contrôles existants. Ce protocole utilise l’histologie standard et les réactifs IHC et des méthodes pour rendre reproductibles les étalons de composition connue. Ces contrôles permettent à différents laboratoires d’étalonner et de normaliser les tests IHC pour de nombreux tests pertinents sur le plan diagnostique.

Il est important de trouver un solvant approprié pour dissoudre le peptide ou la protéine. Il peut être difficile de mélanger rapidement des solutions d’antigène et de formaldéhyde sans introduire de bulles. Pour commencer, préparez 20 millilitres d’une solution de BSA à 25% poids par volume en mélangeant cinq grammes de poudre BSA dans 14 millilitres de PBS, dans un tube conique de 50 millilitres jusqu’à ce qu’ils soient répartis uniformément.

Vortex la solution pour dissoudre la poudre BSA. Gardez la solution toute la nuit à quatre degrés Celsius pour une dissolution complète. Le lendemain, réglez le volume final à 20 millilitres avec PBS.

De même, préparer 20 millilitres d’une solution de BSA à 31,3% poids en volume en mélangeant 6,26 grammes de poudre BSA dans 13 millilitres de PBS. Après une incubation nocturne pour une dissolution complète, régler le volume final à 20 millilitres avec du PBS. Pour vérifier que le mélange de formaldéhyde BSA forme un gel, préchauffer un bloc de chaleur à 85 degrés Celsius.

Mélangez ensuite 700 microlitres de la solution BSA à 25% avec 700 microlitres de formaldéhyde à 37%. Bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois en cinq à 10 secondes sans créer de bulles d’air. Immédiatement après le mélange, placez le tube microcentrifuge fermé dans le bloc de chaleur préchauffé à 85 degrés Celsius.

Après 10 minutes, retirez le tube du bloc de chaleur. Laissez-le refroidir et confirmez que le gel s’est formé comme prévu. Préparez et étiquetez clairement huit tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre.

Préparez ensuite une solution mère de peptide 5x, ajoutez une concentration de 12,5 millimolaires en remettant en suspension toute la masse du peptide libéralisé dans 60 microlitres du solvant approprié. Observez la solution pour vous assurer que le peptide est complètement dissous. Ensuite, ajoutez un volume supplémentaire de solvant si nécessaire pour obtenir une solution de 12,5 millimolaires en fonction du poids moléculaire, de la masse et de la pureté des peptides.

Dans cet exemple, le stock de peptides 5x a un volume final de 626,9 microlitres. D’autres échantillons de peptides nécessiteront un volume final différent. Ensuite, préparez 150 microlitres d’une solution mère de peptide 1x, ajoutez une concentration de 2,5 millimolaires en diluant 30 microlitres du stock de peptide 5x dans 120 microlitres du solvant.

Vortex la solution pendant cinq secondes et centrifuger à température ambiante. Ensuite, préparez 700 microlitres d’une solution de BSA peptidique 0,5 millimolaire en diluant 140 microlitres du stock de peptide 1x dans 560 microlitres de la solution BSA à 31,3%. Après vortex, centrifuger la solution à température ambiante.

De même, préparer quatre dilutions successives en série 10x du stock de peptide BSA en ajoutant 70 microlitres de la solution de peptide BSA à 630 microlitres de la solution BSA à 25%. Pour préparer les gels peptidiques BSA, ajouter 37% de formaldéhyde aux dilutions de peptide BSA dans un rapport un à un en travaillant un échantillon à la fois. Bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois en cinq à 10 secondes sans créer de bulles d’air.

Après mélange, placez le tube microcentrifuge fermé dans un bloc de chaleur à 85 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois que toutes les solutions peptidiques de BSA et de formaldéhyde ont été préparées et chauffées, laissez les gels refroidir sur la paillasse pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une spatule de laboratoire jetable propre et flexible, retirez l’échantillon de gel du tube microcentrifuge en un seul morceau.

Et placez-le dans un récipient scellé contenant au moins 15 millilitres de formol tamponné neutre, en utilisant un récipient séparé pour chaque échantillon. Alternativement, à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir à simple tranchant, coupez le fond du tube microcentrifuge et poussez le gel hors du fond avec de l’air ou une sonde appropriée. À l’aide d’un rasoir à simple tranchant propre, coupez le cône de gel en disques cylindriques d’environ cinq millimètres d’épaisseur.

Après avoir enveloppé les disques dans une enveloppe de biopsie, placez un disque de gel plus grand dans une cassette et les disques de gel restants ensemble dans une deuxième cassette pour une utilisation dans la construction de microréseaux tissulaires. Avant le traitement, placez les gels de cassette dans au moins 15 millilitres de formol tamponné neutre à 10% par gel, en utilisant un récipient séparé pour chaque échantillon. Ensuite, traitez les gels dans un processeur de tissus histologique automatisé en suivant un grand programme de tissus avec pression et vide.

Lorsque le traitement de l’échantillon est terminé, retirez les cassettes du processeur de tissus et déplacez-les vers le centre d’enrobage de la paraffine. Après avoir déballé les gels de l’enveloppe de biopsie, incorporer les gels dans de la paraffine ou chaque échantillon incorporer un disque de gel dans un petit moule de 15 par 15 millimètres. Et les disques de gel restants ensemble dans un deuxième moule plus grand.

Pour chaque série de dilution peptidique, créer deux lames de verre contenant un total de six sections distinctes. Une section de chacun des cinq échantillons de la série de dilutions et une section de l’échantillon témoin négatif BSA uniquement. Après avoir sectionné et séché les lames, colorer les deux lames préparées pour chaque peptide avec l’anticorps primaire souhaité.

Selon les protocoles d’immunohistochimie standard, attendez-vous à voir un signal relativement uniforme dans chaque section de gel. Avec les différents échantillons de gel montrant une gamme d’intensité de signal correspondant aux dilutions peptidiques. Pour la construction du microréseau de tissus en gel BSA, couper des sections de quatre micromètres d’épaisseur du microréseau tissulaire et colorer avec un anticorps monoclonal de lapin conformément aux protocoles standard de laboratoire.

Évaluez qualitativement l’intensité des taches résultantes par inspection ou achetez quantitativement la numérisation et l’analyse d’images numériques. Après avoir réagi avec les anticorps appropriés, les échantillons de gel BSA de contrôle négatif seulement ont montré un signal minimal. L’intensité du signal dans un échantillon de gel individuel est relativement uniforme et augmente avec l’augmentation des concentrations d’antigènes.

Plus de 10% des cellules MDA-MB-175 présentent une coloration membraneuse faible et complètement circonférentielle. En revanche, plus de 10% des cellules SKBR-3 présentent une coloration membraneuse intense complètement circonférentielle Travailler rapidement une fois le formaldéhyde ajouté car les solutions commenceront à geler même à température ambiante. Nous utilisons cette méthode pour effectuer des contrôles IHC lors du test de nouveaux anticorps afin de nous donner confiance que le test a fonctionné comme prévu, même lorsque les anticorps testés ne montrent aucun signal.

Les contrôles de tissus ou de lignées cellulaires sont intrinsèquement variables. Les contrôles d’antigènes synthétiques nous permettent de mesurer plus précisément l’effet de la modification de conditions de réaction ISD spécifiques.