Imagerie et analyse automatisées pour la quantification des macropinosomes marqués par fluorescence

La macropinocytose est une voie endocytaire importante pour une variété de processus cellulaires, y compris le métabolisme du cancer. Ce protocole permet de quantifier l’étendue de la macropinocytose dans les cellules in vitro. L’automatisation vise à maximiser la reproductibilité, la productivité et à réduire les variations expérimentales.

De plus, la microscopie fluorescente vous permet d’inspecter visuellement l’échantillon pour déterminer la qualité expérimentale et évaluer les caractéristiques supplémentaires des macropinosomes. Cheska Marie Galapate, assistante de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec moi. Pour la plaque à 24 puits avec format de couvercle, utilisez une pince pour saisir un seul couvercle du bain d’éthanol.

Appuyez sur le couvercle sur la paroi intérieure de la plaque pour éliminer l’excès d’éthanol et placez le couvercle à plat sur le fond du puits. Une fois que l’éthanol s’est évaporé, lavez le couvercle deux fois avec du DPBS, puis ensemencez les cellules au-dessus du couvercle en ajoutant 500 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits. Placez les cellules dans un incubateur cellulaire de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la confluence cellulaire atteigne 60 à 80% la veille du marquage des macropinosomes.

La veille du marquage des macropinosomes, remplacez les milieux dans les puits par 500 microlitres de milieux préchauffés sans sérum et placez les cellules dans l’incubateur pendant 16 à 24 heures. Pour le format de microplaque de 96 puits, commencez par transférer la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif de 25 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, ensemencez 100 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une microplaque noire de 96 puits à haute teneur avec un fond en oléfine cyclique ou en verre optiquement clair.

Incuber les cellules jusqu’à ce que la confluence cellulaire atteigne 60 à 80% la veille du marquage des macropinosomes. La veille de l’étiquetage des macroponosomes, retirez et jetez le support de chaque puits à l’aide d’un adaptateur d’aspiration multicanal pour les embouts standard fixés à une pompe à vide. Alternativement, une pipette multicanal peut être utilisée.

À l’aide d’un réservoir de réactif et d’une pipette multicanal, ajoutez doucement 100 microlitres de milieux préchauffés sans sérum à chaque puits, puis placez les cellules dans l’incubateur cellulaire pendant 16 à 24 heures. Pour la plaque de 24 puits avec format de couvercle, remplacez le milieu dans les puits par 200 microlitres de milieu sans sérum par du dextran de haut poids moléculaire marqué au fluorophore et placez les cellules dans l’incubateur cellulaire pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirez le milieu et lavez doucement mais rapidement les cellules cinq fois avec du PBS glacé à l’aide d’un flacon de lavage pré-refroidi.

Serrez fermement la plaque à la main pendant les lavages pour aider à déloger les agrégats de dextran qui se collent aux couvercles. Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 350 microlitres de formaldéhyde à 3,7% et en incubant pendant 20 minutes, puis aspirez la solution de fixation et lavez les cellules avec du PBS deux fois. Colorez les noyaux avec 350 microlitres de DAPI dans PBS.

Après 20 minutes, aspirer la solution de DAPI et laver les cellules avec du PBS trois fois. Collez les isolateurs en silicone côte à côte sur une lame de microscope pour obtenir un espacement uniforme et une localisation reproductible des couvercles nécessaires à l’automatisation de l’imagerie. Ensuite, pour chaque couvercle, ajoutez une goutte de support de montage de fluorescence de durcissement sur la lame du microscope dans l’espace ouvert de l’isolateur.

Ramassez un couvercle à l’aide d’une pince et retirez l’excès de PBS en tapotant doucement le côté des couvercles sur une lingette non pelucheuse. Ensuite, placez le couvercle à l’envers sur la goutte du support de montage et appuyez doucement sur le couvercle à l’aide de pinces fermées pour éliminer les bulles du support de montage. Rangez les diapositives dans un environnement sombre et laissez le support de montage sécher à température ambiante, ce qui prend généralement de 16 à 24 heures.

Avant l’imagerie, retirez les isolateurs de la lame du microscope. Une fois les lames équilibrées à la température ambiante, nettoyez les couvercles à l’aide d’un applicateur à pointe de coton mouillé avec un nettoyant pour vitres sans ammoniaque. Par la suite, utilisez un applicateur à pointe de coton propre mouillé avec de l’éthanol à 70% pour nettoyer le couvercle et le laisser sec.

Pour le format de microplaque à 96 puits, après avoir aspiré les puits comme démontré précédemment, ajoutez 40 microlitres de milieux sans sérum avec du dextran de haut poids moléculaire marqué au fluorophore dans les puits, puis incubez les cellules dans l’incubateur cellulaire pendant 30 minutes. Après l’incubation, jetez le support dans la microplaque en faisant glisser manuellement la plaque à l’envers dans un bécher vide de cinq litres, puis rincez les cellules et la microplaque deux fois en immergeant lentement la plaque verticalement à un léger angle dans un bécher de deux litres rempli de PBS glacé et en jetant ensuite le PBS dans la microplaque en faisant glisser la plaque à l’envers dans le bécher de cinq litres. Après le dernier rinçage PBS, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 3,7% dans PBS à chaque puits à l’aide d’un réservoir de réactif de 25 millilitres et d’une pipette multicanal.

Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, retirez la solution de fixation et lavez les cellules avec du PBS en utilisant la technique d’immersion et de flicking. Après le deuxième lavage PBS, colorez les noyaux avec 100 microlitres de DAPI dans PBS par puits. Après 20 minutes, rincez les cellules trois fois avec du PBS glacé comme démontré précédemment.

Retirez tout PBS résiduel en tapotant la microplaque à l’envers sur une lingette non pelucheuse. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS frais à chaque puits à l’aide d’un réservoir de réactif de 25 millilitres et d’une pipette multicanal. Avant l’imagerie, laissez la plaque s’équilibrer à la température ambiante, puis essuyez la plaque de culture cellulaire avec une lingette non pelucheuse.

Alternativement, conservez la plaque couverte à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant une semaine. Pour l’imagerie automatisée des macropinosomes, créez un protocole d’automatisation pour acquérir les images avec un objectif d’air 40X dans le canal de longueur d’onde du fluorophore dextran et du DAPI. Ensuite, optimisez les paramètres d’exposition à l’aide d’un échantillon dont le niveau de macropinocytose est le plus élevé pour éviter la surexposition, ce qui peut entraîner une saturation du signal et une perte de données d’intensité.

Utilisez des paramètres de mise au point qui localisent facilement et systématiquement l’échantillon pour produire des images de haute qualité. Acquérir plusieurs images dans chaque puits ou couvercle pour tenir compte de la variabilité de l’échantillon et obtenir une représentation précise de l’échantillon. Pour déterminer l’indice macropinocytaire, soustrayez l’arrière-plan du DAPI et de l’image dextran correspondante en appliquant la fonction appropriée, souvent appelée fonction de boule roulante.

Ajustez les paramètres de sorte que le bruit de fond soit minimisé avec un effet de soustraction minimal ou nul sur le signal DAPI et dextran. Ensuite, à l’aide d’un champ avec un signal de dextran élevé, déterminez les paramètres du signal d’intensité, souvent appelé la fonction de seuil, pour sélectionner les noyaux, puis déterminez le réglage du signal d’intensité minimale requis pour sélectionner uniquement les macroponosomes. Pour l’image de dextran, calculez la fluorescence totale dans la sélection de macropoinosomes créée ou utilisez la sélection pour déterminer la surface totale positive pour le dextran.

Pour l’image DAPI, utilisez la sélection pour déterminer le nombre de noyaux dans l’image afin de refléter le nombre de cellules présentes. Déterminez ensuite l’indice macropinocytaire en divisant la fluorescence ou la surface totale du dextran par le nombre de cellules déterminé par DAPI. Dans les cellules PDAK AsPC-1, l’ajout d’EGF à 100 nanogrammes par millilitre pendant cinq minutes avant d’ajouter le dextran active la macropinocytose.

De plus, l’activation autocrine EGF de la macropinocytose peut être induite par la privation de glutamine pendant 16 à 24 heures. Les cellules MIA PaCa-2 présentent une macropinocytose constitutive qui est inhibée par un traitement de 30 minutes avec 75 EIPA micromolaires ou un traitement de deux heures avec 10 EHop-016 micromolaires. Dans une expérience dose-réponse, l’indice macropinocytaire a progressivement diminué à des concentrations plus élevées d’EHop-016 et d’EIPA, confirmant ainsi l’existence d’une macropinocytose constitutive dépendante de Rac1.

Vous pouvez adapter cette procédure pour évaluer la macropinocytose d’autres cargaisons marquées par fluorescence telles que l’albumine. En outre, il est recommandé d’évaluer si l’absorption macropinocytaire de l’albumine contribue à la capacité cellulaire en effectuant des tests de viabilité cellulaire. Cette technique a été essentielle à l’identification de l’apport en nutriments macropinocytaires dans les cellules cancéreuses et stromales et l’automatisation a considérablement augmenté notre capacité de test de l’état.