Construction de membranes lipidiques modèles incorporant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

Ce protocole utilise le gonflement de l’agarose comme une technique puissante et généralisable pour incorporer des protéines membranaires intégrales (PIM) dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (GUV), comme décrit ici pour la reconstitution de la protéine réceptrice de la sérotonine 1A humaine (_5-HT1AR), l’une des classes de récepteurs couplés à la protéine G pharmacologiquement importants.

L’étude des protéines membranaires intégrales dans leur environnement natif a été un défi en raison de la complexité de la membrane plasmique. Les vésicules lipidiques unilamellaires géantes, ou GUV, sont l’une des plates-formes les plus importantes pour étudier les propriétés de la biomembrane et elles peuvent être conçues pour imiter diverses conditions physiologiques. Ce protocole décrit une méthode de fabrication de GUV incorporés à des protéines à partir d’une incorporation spontanée, après un gonflement de l’hydrogel. Les méthodes traditionnelles de fabrication des GUV ne sont pas généralisables pour l’incorporation de protéines membranaires intégrales. Ces méthodes sont souvent à faible rendement, méthodologiquement complexes et ad hoc, non applicables à de grandes classes de protéines. D’autre part, ce protocole représente une méthode flexible, robuste et simple pour incorporer des protéines membranaires intégrales fonctionnelles dans les GUV.Nous avons accompli cela en préparant un échafaudage d’hydrogel, contenant la protéine, et en déposant une fine couche de lipide sur le dessus. Dans l’exemple présenté ici, nous avons incorporé le récepteur couplé à la protéine G, ou RCPG, dans les GUV.Lors de la réhydratation de l’ensemble du système, les GUV bourgeonnent de la surface de l’hydrogel avec la membrane contenant des RCPG correctement orientés.Permettez à tous les réactifs d’atteindre la température ambiante. Pendant ce temps, nettoyez les glissements du couvercle en les plaçant dans du méthanol et en sonifiant pendant 30 minutes à 40