Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

L’alimentation artificielle et la collecte de salive fournissent une méthode directe pour détecter les effecteurs dans la salive des insectes. Cependant, cela n’a pas été décrit en détail auparavant. Ce protocole est efficace pour la collecte de la salive des insectes saprophytes.

De plus, c’est une technique simple, car nous utilisons un milieu contenant uniquement du saccharose comme régime artificiel. La salive des insectes saprophytes peut affecter le système immunitaire de l’hôte pour améliorer le comportement alimentaire et transmettre des agents pathogènes. Ce médicament qui peut être utilisé pour le comportement des insectes et la recherche sur la voie osseuse des insectes.

C’est une méthode simple à effectuer. Cependant, cela suggère la mise en place d’un environnement expérimental propre car la salive est collectée pour d’autres recherches. Commencez par préparer une solution de saccharose à 5% pour l’alimentation artificielle et filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer la contamination bactérienne et les impuretés.

Affamer environ 200 petites larves de larves de plantes brunes pendant trois à cinq heures avant de les introduire dans une chambre d’alimentation. Ensuite, pour préparer les cylindres de verre en tant que chambres d’alimentation, couvrez une extrémité ouverte de la chambre avec une membrane de paraffine avant d’introduire les insectes expérimentaux, puis transférez les insectes dans le cylindre de verre et recouvrez l’autre extrémité de la chambre avec une membrane de paraffine tendue. Ajouter 200 microlitres de régime artificiel sur la membrane, puis couvrir le liquide avec une autre couche de membrane de paraffine étirée.

Enfin, couvrez la chambre avec du papier d’aluminium, en laissant l’extrémité avec l’appareil de régime artificiel exposé à la lumière. Après 24 heures, recueillir la salive SBPH en refroidissant le cylindre à quatre degrés Celsius pour immobiliser les insectes, puis découvrir le film extérieur et recueillir le régime artificiel dans des tubes stériles de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette stérile. Conservez la salive recueillie à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse.

Ensuite, rincez la membrane interne avec 50 microlitres de régime artificiel frais trois fois en pipetant doucement et collectez le régime de lavage artificiel dans des tubes stériles de 1,5 millilitre. Après les trois rinçages, ajoutez un régime artificiel frais sur la membrane interne et placez une membrane de paraffine fraîchement étirée sur le dessus. Enfin, filtrez les échantillons prélevés à travers une unité de filtration de 0,22 micron pour éliminer les microbes et autres contaminants.

Transférer les échantillons collectifs de salive dans un filtre centrifuge de 500 microlitres et 10 kilodaltons. Centrifuger l’échantillon. Collectez le surnageant et portez le volume final à 100 microlitres.

Pour mesurer la concentration de la salive collectée, allumez le spectrophotomètre UV visible et lavez les piédestaux trois fois avec de l’eau doublement distillée. Sélectionnez les options à l’écran dans l’ordre suivant, protéines, protéine A280. Sélectionnez le type et une unité d’absorbance égale à un milligramme par millilitre.

Cochez ensuite la case de correction de base, 340 nanomètres. Ensuite, chargez deux microlitres de solution aqueuse de saccharose à 5% à blanc, puis appuyez sur Blank en bas de l’écran. Enfin, après avoir établi les normes, chargez deux microlitres de la salive collectée et enregistrez la concentration en protéines.

En se nourrissant de 5% de saccharose, plus de 80% de SBPH ont survécu pendant les quatre premiers jours. Cependant, à partir du cinquième jour, la mortalité a augmenté rapidement à 40% et le septième jour, moins de la moitié du SBPH a survécu. Une analyse de page SDS a montré que les échantillons de salive concentrés de salive SBPH infectée par le VRS contenaient beaucoup plus de protéines que le témoin négatif à 5% de saccharose.

Dans une analyse par transfert western pour la détection de la protéine de la capside du VRS, un insecte non infecté et virulifère. La protéine de la capside du VRS a été détectée avec succès dans l’échantillon virulifère, un anticorps conçu contre le produit du gène LssgMP a détecté une protéine de 78 kilodaltons dans des échantillons non infectés et virulifères, démontrant que LssgMP est une protéine salivaire. Une analyse PAR PCR QRT des niveaux de transcription de LssgMP dans différents tissus a montré que les niveaux de transcription de Lssg dans la glande salivaire étaient 20 fois plus élevés que dans tout le corps et l’intestin, confirmant l’expression spécifique de LssgMP dans la glande salivaire.

Affamer les insectes expérimentaux avant de les introduire dans la chambre est nécessaire pour assurer l’efficacité de notre collecte de salive. En outre, un milieu artificiel doit être collecté et échangé toutes les 24 heures pour réduire la contamination microbienne dans l’échantillon prélevé. Cette technique fournit une méthode directe pour étudier la fonction de la salive dans la transmission des agents pathogènes.

En outre, il peut aider à étudier l’interaction de l’hôte pathogène des insectes.