Test d’absorption des vésicules extracellulaires par analyse d’imagerie au microscope confocal

Ce protocole fournit une méthodologie robuste pour l’analyse des véhicules électriques au niveau cellulaire et une approche pratique pour une adoption efficace des véhicules électriques et une analyse du suivi des véhicules électriques. Cette méthode d’étiquetage des véhicules électriques élimine la coprécipitation des véhicules électriques et des colorants, améliorant ainsi les signaux des véhicules électriques. L’absorption des VE est mesurée par analyse volumétrique pour distinguer les VE internalisés des VE superficiels.

Les véhicules électriques sont des cargaisons actives, leur absorption permet ainsi le transfert de molécules biochimiques. Pour la recherche sur l’administration de médicaments à base de VE et le traitement du cancer, cette technique peut être un outil d’évaluation. L’adoption des VE joue un rôle dans la communication intercellulaire et est étudiée dans divers domaines de recherche, tels que la biologie du cancer, les neurosciences et l’administration de médicaments.

Ce protocole facilite potentiellement un test efficace d’absorption des VE. Pour isoler les vésicules extracellulaires, ou VE, injecter un millilitre de milieu de culture cellulaire prétraité dans la chambre d’échantillonnage du dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration. Pour faire fonctionner l’appareil, faites tourner l’appareil dans la machine à filer de paillasse à 3000 tr / min pendant 10 minutes.

Après la filature, retirez le fluide de la chambre à déchets par pipetage ou aspiration, puis répétez cette procédure deux fois pour traiter deux millilitres supplémentaires du milieu de culture cellulaire. Ensuite, pour laver les véhicules électriques isolés, injectez un millilitre de PBS dans la chambre d’échantillonnage et faites tourner l’appareil dans la machine à filer de paillasse. Pour le marquage immunofluorescent des VE, injecter un microgramme par millilitre de l’anticorps spécifique EV dans le trou d’élution du dispositif contenant 100 microlitres de VE isolés.

Ensuite, incubez pendant une heure dans l’obscurité sur un agitateur à plaque pour assurer la répartition uniforme de l’anticorps dans l’échantillon. Ensuite, fixez un ruban adhésif au trou d’élution. Injecter un millilitre de PBS dans la chambre d’échantillonnage pour éliminer les anticorps résiduels, puis faire tourner l’appareil jusqu’à ce que la chambre d’échantillonnage soit vide.

Répétez le lavage en injectant un autre millilitre de PBS dans la chambre d’échantillonnage et en faisant tourner l’appareil comme démontré précédemment. Après avoir retiré le liquide résiduel de la chambre, pipettez les véhicules électriques marqués par fluorescence de la chambre à membrane dans un tube ambré ou un microtube. Protégez le tube de la lumière jusqu’à son utilisation.

Ensemencez quatre fois 10 à la quatrième cellule PC3 dans un plat de 35 millilitres avec un milieu millilitre. Permettre aux cellules d’adhérer pendant la nuit dans des conditions de culture cellulaire optimales. Le lendemain, lavez les cellules adhérentes deux fois avec des milieux appauvris en exosomes.

Après avoir dilué les VE marqués par fluorescence à la concentration appropriée à l’aide d’un milieu appauvri en exosomes, ajoutez les VE dilués aux cellules cibles adhérentes et incubez pendant le temps expérimental souhaité. Après avoir éliminé les VE non internalisés en lavant les cellules trois fois avec des milieux sans exosomes, marquez le cytoplasme des cellules adhérentes avec un microgramme par millilitre de CMTMR et incubez dans des conditions de culture cellulaire optimales. Pour l’imagerie des cellules vivantes, placez les cellules préparées dans l’incubateur sur scène.

Après avoir défini les paramètres d’imagerie en fonction des échantillons de contrôle, déterminez la profondeur des cellules cibles et la plage de taille d’empilement dans la direction Z pour acquérir des images confocales 3D, puis réglez l’acquisition d’image sur plusieurs images empilées Z de colorant spécifique à la cellule et de colorant spécifique EV simultanément. Pour le traitement d’image, utilisez un logiciel de traitement d’image automatique. Pour construire des surfaces virtuelles des cellules, cliquez sur Ajouter de nouvelles surfaces.

Pour configurer les surfaces de cellule virtuelle, cliquez sur le bouton Ajouter et sélectionnez Qualité comme type de filtre. Seuilz la valeur appropriée pour la limite basse par inspection visuelle, définissez la valeur maximale pour la limite supérieure, puis cliquez sur le bouton Terminer Suivant, pour créer les points virtuels des véhicules électriques, cliquez sur le bouton Ajouter de nouveaux spots. Sous Paramètres de l’algorithme, sélectionnez Différentes tailles de spot et Calcul de la distance la plus courte, puis cliquez sur Suivant et sélectionnez Canal 1 Alexa Fluor 488 comme canal source.

Entrez la valeur appropriée pour le diamètre XY estimé sous Détection ponctuelle et cliquez sur Suivant. Pour configurer les points EV virtuels, cliquez sur le bouton Ajouter et sélectionnez Qualité comme type de filtre. Définissez le seuil inférieur par une inspection visuelle et cliquez sur Suivant pour le type de régions ponctuelles, sélectionnez Intensité absolue, puis cliquez sur Suivant.

Pour seuilr la région des points EV, entrez la valeur appropriée pour Seuil de région par inspection visuelle. Sélectionnez Diamètre à partir de sous Volume de la région et cliquez sur Terminer. Pour diviser les points groupés à l’intérieur de la surface construite, cliquez sur les points de construction et allez dans Filtres.

Cliquez ensuite sur le bouton Ajouter et sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces, Surfaces Surface 1 comme type de filtre. Après avoir défini le seuil le plus bas pour la limite basse et la valeur appropriée pour la limite supérieure, cliquez sur le bouton Dupliquer la section vers le nouveau spots. Pour le comptage automatique des véhicules électriques à l’intérieur des cellules, cliquez sur la sélection Spots construits 1, accédez à Statistiques et exportez la valeur à partir du nombre total de points.

Pour obtenir le nombre de cellules, cliquez sur Surfaces construites 1, puis accédez à Statistiques et exportez la valeur du Nombre total de surfaces à partir de l’ensemble. Enfin, allez dans l’onglet Détaillé sous Statistiques pour exporter le volume. Les VE isolés à partir de milieux de culture cellulaire PC3 à l’aide d’un dispositif microfluidique basé sur la nanofiltration ont été marqués avec un anticorps spécifique à l’EV conjugué au fluoro-4 et visualisés à l’aide de la microscopie confocale 3D.

Les VE internalisés ont été visualisés comme des puncta et un EV.Post-traitement individuel de ces images permet la visualisation et la quantification de l’internalisation des VE dans les cellules. Les résultats du test d’absorption de VE indiquent que le niveau d’absorption de VE dépend de la durée de la période d’incubation. Le nombre de VE internalisés peut être normalisé au volume de la cellule réceptrice afin de déterminer le taux réel d’absorption des VE pour la cellule spécifiée.

Cette procédure permet l’exclusion systématique des VE non internalisés pour mesurer avec précision le nombre de VE internalisés. La distribution de taille des points EV internalisés est montrée ici. Les étapes clés sont donc l’utilisation du dispositif microfluidique pour le marquage des VE, la minimisation de la fluorescence de fond lors de la visualisation des VE fluorescents, puis l’analyse post-imagerie pour déterminer les VE internalisés par rapport aux VE superficiels.

Ainsi, le suivi intracellulaire des VE peut être effectué en temps réel sur un plan 3D, et en outre, l’analyse du trafic ev sur les résolutions spatiales / temporelles et la co-localisation des VE avec des organites subcellulaires peut être réalisée. Nous pensons donc que cette technique offre un moyen plus facile et plus efficace d’étudier les VE dans les matrices intra-et extracellulaires pour les chercheurs dans le domaine de la communication cellulaire pour les VE.