Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

Les neutrophiles sont des cellules différenciées en phase terminale, et il n’existe actuellement aucune lignée cellulaire pour récapituler complètement la biologie des neutrophiles. Ainsi, il est nécessaire d’obtenir des neutrophiles purs, inactivés, sains et frais pour étudier leur biologie. Cette méthode de rafraîchissement combine gradient de densité, sédimentation, lyse douce pour obtenir une préparation neutrophile pure.

Il est facile à mettre en place, nécessite un équipement simple et peu de pratique. L’aspect technique, tel que la superposition de dégradés, de cette méthode nécessitera une certaine pratique à maîtriser, mais une fois le dégradé perfectionné, les autres étapes devraient venir comme un jeu d’enfant. Commencez par stériliser le manteau bouffi, l’emballage et la capuche laminaire.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de sang dans un tube de 50 millilitres. Pour diluer le sang pour un nettoyage du gradient, ajoutez 5% FBS / HBSS et composez le volume jusqu’à 35 millilitres. Après avoir fermé le couvercle, inverser le tube plusieurs fois pour le mélanger, puis garder le tube à l’envers pour obtenir le fond dépourvu de globules rouges.

Ajouter 10 millilitres du milieu de gradient de densité directement sous le sang, en veillant à ce que le milieu et le sang ne se mélangent pas et que l’interface reste nette. Faites tourner le tube à 400 g pendant 30 minutes à température ambiante, en veillant à désactiver le frein. Après la filature, observez le gradient séparé en une couche de plasma sérique supérieure, un anneau blanc moyen de cellules mononucléaires du sang périphérique, une couche moyenne de gradient de densité trouble et une pastille inférieure constituée d’une fine bande de neutrophiles blanches au-dessus des globules rouges.

Pour éliminer le PBMC, faites sortir la pipette d’aspiration directement dans la couche de PBMC et aspirez complètement pendant que la couche de plasma sérique diminue à mesure que l’anneau est retiré. Grattez le côté du tube avec la pipette d’aspiration pour maximiser l’élimination du PBMC. Retirez soigneusement la couche de milieu de gradient de densité trouble entre l’anneau PBMC et la pastille de neutrophile/RBC.

Pour la sédimentation érythrocytaire, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la pastille de neutrophiles/globules croisés dans un tube propre. Ajoutez ensuite 5 % de FBS/HBSS à un volume final de 25 millilitres. Ajouter directement 25 millilitres de la solution préwarmée contenant 3% dextran/0,9% DeCl dans l’eau dans le tube et mélanger doucement par inversion.

Placez le tube sur une surface nivelée et non vibrante pendant 15 minutes. Après avoir remis le tube dans la hotte, immergez légèrement la pipette dans le liquide et collectez environ 30 millilitres de la couche supérieure en suivant la surface du liquide vers le bas. Faites tourner le tube pour obtenir une pastille rouge sans particules flottantes dans le milieu.

Pour la lyse des globules droits résiduels, aspirer doucement le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter 25 millimètres d’eau ultrapure stérile directement dans le tube et mélanger doucement en inversant le tube pendant 28 secondes pour lyser le GLOBULER. Ensuite, ajoutez immédiatement 25 millilitres de solution stérile de NaCl à 1,8% préparée dans l’eau dans le tube et ramenez la solution aux conditions isotoniques par mélange doux.

Faire tourner le tube à 200 fois g pendant trois à cinq minutes avec un frein bas pour minimiser la sédimentation des globules anneaux et des plaquettes avec les neutrophiles. Pour la réutilisation de la pastille de neutrophile blanc, ajoutez directement le milieu de culture sur la pastille, mais ne pipetez pas de haut en bas. Ensuite, bercez le tube horizontalement d’un côté à l’autre pour minimiser l’activation des cellules.

Si une agrégation ou un agglutination cellulaire est observé, filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage de 70 micromètres pour éliminer les neutrophiles agglomérés. Pour évaluer la qualité de la préparation de neutrophiles isolés, colorez les cellules avec des marqueurs spécifiques aux neutrophiles, aux éosinophiles et à un marqueur d’activation. Après avoir acquis 20 000 cellules par cytométrie en flux, analysez la pureté et l’activation des cellules à l’aide des stratégies de contrôle et déterminez la viabilité cellulaire à l’aide de l’annexine V / iodure de propidium comme décrit dans le manuscrit du texte.

Le gradient de densité à faible vitesse a donné des neutrophiles avec plus de pureté, tandis qu’une vitesse élevée a entraîné une augmentation du rendement au détriment de la pureté. En utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence, la distribution cellulaire seule a fourni une estimation de la qualité de l’isolement cellulaire, mais l’utilisation de marqueurs cellulaires spécifiques devrait être préférée. Les populations cellulaires contaminantes identifiées étaient des monocytes, des lymphocytes et des éosinophiles.

L’énorme rendement en neutrophiles a été obtenu en utilisant ce protocole. L’expression de CD62L a été évaluée. L’intensité fluorescente moyenne pour CD62L a diminué dans les cellules témoins positives, ce qui indique une excrétion de CD62L et une activation des neutrophiles.

La santé des neutrophiles doit être évaluée avant d’effectuer le test, car les neutrophiles ont une demi-vie relativement courte et l’activation raccourcit encore la durée de vie. Après purification des neutrophiles à l’aide du gradient de densité et des microbilles commerciales, les cellules ont été cultivées pendant 24 heures et la survie cellulaire a été analysée par cytométrie en flux. La quantification des cellules viables a indiqué que la purification du gradient de densité a donné lieu à plus de cellules viables après 24 heures qu’à la purification à l’aide d’un kit.

Il est important que les étapes de superposition de gradient et de centrifugation soient effectuées aussi bien que possible, car cela aura un impact considérable sur la qualité de la préparation. Des expériences in vitro et des tests biochimiques peuvent être effectués en suivant cette procédure. En outre, une sélection négative pourrait être effectuée si des cellules ultrapures sont nécessaires, comme dans les expériences d’expression de cytokines et de protéines.