Name: Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Apprenez à isoler des neutrophiles humains purs et non activés à partir de sang total et de buffy coat. Cette méthode combine centrifugation sur gradient de densité, sédimentation érythrocytaire et lyse douce pour maximiser la pureté et la viabilité cellulaire.

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REMARQUE: Les neutrophiles humains ont été isolés du sang veineux à partir de filtres de globules blancs jetés obtenus auprès du laboratoire de la banque de sang du Boston Children’s Hospital. Les donneurs de sang n’étaient pas identifiables et il n’y avait aucune interaction avec des personnes vivantes ni connaissance de renseignements personnels identifiables. Par conséquent, ce travail n’est pas classé comme sujet humain de recherche en vertu du règlement HHS sur les sujets humains (45 CFR Part 46). Le Boston Children’s Hospital Institutional Review Board (IRB) a approuvé le protocole.
1. Superposition du dégradé
<ol><li>Après avoir stérilisé le manteau bouffant ou l’emballage de sang total et la hotte laminaire, divisez le sang en tubes de 50 mL avec 10 mL de sang dans chaque tube.</li>
	<li>Porter le volume à 35 mL avec 5 % de sérum fœtal bovin (FBS)/solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour diluer le sang pour un gradient plus propre. REMARQUE: Lors de l’utilisation d’une membrane de leucaphérèse, les cellules peuvent être évacuées à l’aide d’une seringue de 60 mL et de 30 mL de 5% FBS / HBSS par filtre. La dilution n’est pas nécessaire lorsque vous travaillez avec du sang total fraîchement prélevé.</li>
	<li>Fermez le couvercle du tube de 50 mL, mélangez-le plusieurs fois par inversion et gardez-le à l’envers pour que le fond soit dépourvu de globules fermés.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de milieu de gradient de densité (voir le Tableau des matériaux)directement sous le sang. Assurez-vous que le milieu et le sang ne se mélangent pas et que l’interface est nette (Figure 1A). REMARQUE: Cette étape est cruciale. Assurez-vous que la solution de gradient de densité est à température ambiante (RT) et bien mélangée avant chaque gradient. Le premier millilitre du milieu de gradient de densité doit être soigneusement et régulièrement stratifié aussi lentement que possible. Il est recommandé de régler la vitesse de la pipette électronique sur faible.</li>
	<li>Placez doucement le tube dans une centrifugeuse sans perturber le gradient et tournez à 400 × g pendant 30 min à RT, en vous assurant de désactiver le frein. Observez comment le gradient filé se sépare en une couche supérieure de sérum/plasma, un anneau blanc moyen de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBBC), une couche moyenne de gradient de densité trouble et une pastille inférieure constituée d’une bande de neutrophiles blanche et mince au-dessus des globules rouges(Figure 1B). REMARQUE: Un côté trouble ou opaque du tube après centrifugation peut suggérer que les cellules (neutrophiles) sont activées et peuvent ne pas convenir à l’utilisation.</li>
	<li>Retirez d’abord les PBMC en faisant sortir la pipette d’aspiration directement dans la couche PBMC. Assurez-vous de l’aspirer complètement pendant que la couche de sérum / plasma diminue à mesure que l’anneau est retiré. Gratter le côté du tube où les cellules sont arquées avec la pipette d’aspiration pour maximiser l’élimination du PMBC. Retirez soigneusement la couche de milieu de gradient de densité trouble entre l’anneau PBMC et la pastille neutrophile/RBC. REMARQUE: Le grattage des cellules granulées sur le côté du tube augmente considérablement la pureté de l’isolement. Veillez à ne pas aspirer la pastille, car la plupart des neutrophiles sont assis directement sur les globules rb c.</li>
</ol>2. Sédimentation des érythrocytes (globulesraux)
<ol><li>À l’aide d’une pipette de 10 mL, transférer la pastille de neutrophile/RBC dans un tube propre. Ne pas pipeter de haut en bas. Ajouter 5 % de FBS/HBSS à un volume final de 25 mL. Mélanger doucement par inversion. REMARQUE: Effectuer la sédimentation RBC après l’élimination pbMC améliore le rendement et diminue l’activation10.</li>
	<li>Ajouter directement 25 mL de Préchaignement (37 °C) 3 % de Dextran/0,9 % NaCl/H2O dans le tube contenant la pastille diluée de neutrophiles/globules d’états membres et mélanger doucement par inversion. Placer le tube sur une surface plane et non vibrante pendant 15 min(Figure 1C). REMARQUE : Une sédimentation plus longue réduit la contamination par les globules biologiques, mais diminue également le rendement. De plus, une exposition prolongée au dextran peut entraîner l’activation des neutrophiles ou la mort cellulaire11.</li>
	<li>Ramenez doucement le tube dans le capot (pour une isolation stérile). En immergeant légèrement la pipette dans le liquide, collectez la couche supérieure (~30 mL) en suivant la surface du liquide vers le bas. REMARQUE : Si la sédimentation produit une interface nette entre le milieu et les globulesraux, la pastille de globules constitués est plus petite ou, si un rendement plus élevé est souhaité, recueillez jusqu’à 35 mL.</li>
	<li>Faites tourner le tube (400 × g,10 min, RT, à l’aide d’un frein bas (3)), ce qui donne une pastille rouge sans particules flottant dans le milieu.</li>
</ol>3. Lyse des globules rbéraux résiduels
<ol><li>Aspirer doucement le surnageant sans perturber la pastille.</li>
	<li>Ajouter 25 mL d’eau ultrapure stérile directement dans le tube et mélanger doucement en inversant pendant 28 s pour lyser les globules bouclés. N’utilisez pas de pipette pour ressuspender la pastille. REMARQUE: Ne pas dépasser 30 s car des conditions hypotoniques prolongées peuvent s’activer et entraîner la mort des neutrophiles12.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 25 mL de NaCl/H2 O stérile à1,8% dans le tube et mélanger doucement en inversant pour ramener la solution à des conditions isotoniques. REMARQUE: La solution doit être rouge mais sans turbidité.</li>
	<li>Tourner vers le bas à 200 × g pendant 3-5 min avec un frein bas (niveau 3) pour minimiser les globules anneaux et la sédimentation plaquettaire avec les neutrophiles (Figure 1D et Figure 2)13,14. REMARQUE: La pastille doit être blanche avec une couche minimale de globules rouges sur le dessus, qui peut être retirée doucement pendant que le surnageant est aspiré.</li>
	<li>Resuspendez les neutrophiles en pipetant le milieu de culture (10 % FBS/RPMI1640) directement sur la pastille, mais ne pipetez pas de haut en bas. Basculez le tube horizontalement d’un côté à l’autre pour minimiser l’activation cellulaire. REMARQUE: Les cellules doivent être maintenues à une concentration d’environ 2 × 106 cellules / mL, car une densité plus élevée entraînera une augmentation de l’activation / mort cellulaire15. Pour la même raison, la pastille de cellule doit être ressaisie dès que possible.</li>
	<li>Si une agrégation ou un agglutination cellulaire est observé, filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un maillage de 70 μm pour éliminer les neutrophiles agglomérés.</li>
</ol>4. Détermination de la qualité de l’isolement des neutrophiles
<ol><li>Colorez les cellules avec des marqueurs spécifiques aux neutrophiles (CD66b, CD11b), aux éosinophiles (CD193)(Figure 3)et à un marqueur d’activation tel que CD62L(Figure 4). Acquérir 20 000 cellules par cytométrie en flux. Analyser la pureté et l’activation des cellules à l’aide des stratégies de grille proposées à la figure 3 et à la figure 4. REMARQUE: La qualité de la préparation de neutrophiles peut être évaluée à l’aide d’une solution d’acide acétique à 3% de bleu de méthylène pour visualiser le noyau lobé unique des neutrophiles.</li>
	<li>Déterminer la viabilité des cellules à l’aide de l’annexine V/iodure de propidium (IP) (Figure 5). REMARQUE: La coloration au bleu trypan peut être utilisée pour évaluer la viabilité des cellules.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de tout conflit d’intérêts.

En raison de la courte durée de vie, du statut de différenciation terminale et de la teneur en lytiques des neutrophiles, l’étude de ces cellules a toujours été un défi. En plus d’utiliser des modèles murins ou des cellules de cohortes de patients, les lignées cellulaires sont des outils utiles pour aider à étudier la biologie des neutrophiles16. Cependant, les lignées cellulaires de type neutrophile ne peuvent pas répéter complètement tous les aspects de la biologie des neutrophiles, ajoutant une couche supplémentaire de difficulté dans l’étude de ces cellules. Le modèle in vitro le plus couramment utilisé est la lignée cellulaire HL-60, qui peut être différenciée en cellules de type neutrophile par traitement au diméthylsulfoxyde ou à l’acide rétinoïque17,18. Bien que ces cellules soient utiles dans l’étude de la migration et de l’éclatement respiratoire, elles ne conviennent pas à l’étude de l’activité microbiocide des neutrophiles. D’autres lignées cellulaires existent (PLB-98, NB4), et elles sont également associées à leur ensemble de limitations19.
Il est essentiel de valider avec des neutrophiles humains primaires des observations faites avec des modèles de maladies de souris et des lignées cellulaires. Les neutrophiles ne peuvent pas être cryoconservés efficacement et sont donc souvent fraîchement isolés à partir de sang total ou de pelages bouffants obtenus auprès de donneurs et immédiatement traités. Une fois isolées, les cellules commencent à subir une forme complexe de mort spontanée, régulée par l’oxydation, les caspases cytoplasmiques et les protéases présentes dans les granules de neutrophiles20,21. Des méthodes ou des techniques d’isolement inappropriées peuvent conduire à l’activation des neutrophiles, accélérant seulement la disparition des cellules. Il est impératif d’avoir une méthode fiable et cohérente pour obtenir des neutrophiles purs et de haute qualité de donneurs. 
De nombreuses méthodes ont été publiées sur l’isolement des neutrophileshumains10,22. Ils se répartissent principalement en deux catégories, avec quelques stratégies partagées. La première catégorie est à base d’anticorps, soit par sélection positive ou négative. La sélection positive marquerait directement les neutrophiles, fournissant ainsi une population cellulaire très pure, bien qu’elle conduise également à une activation cellulaire rapide, à la mort cellulaire, ainsi qu’à un marquage indésirable des neutrophiles23. La sélection négative, bien qu’elle laisse les cellules sans étiquette et donne une population très pure, accélère la mort des neutrophiles, bien que le mécanisme précis soit inconnu (Figure 5). La question de savoir si l’expression des gènes ou des protéines est également altérée après une sélection positive ou négative doit être étudiée plus avant. De plus, en raison de la quantité d’anticorps nécessaire pour épuiser les autres types de cellules, ces méthodes ne peuvent pas produire de grandes quantités de neutrophiles. Cependant, les tests à base d’anticorps peuvent toujours être utilisés pour la culture à court terme et les expériences à plus petite échelle et sont des méthodes de choix pour les expériences nécessitant une pureté cellulaire très élevée, telles que les études sur l’expression des gènes et des protéines.
Le deuxième type de méthode d’isolement est basé sur le gradient et la densité. Il implique généralement Percoll, Ficoll-Paque ou d’autres composants polysaccharides / polyvinylpyrrolidone et utilise la force de centrifugation pour séparer différents types de cellules sanguines en fonction de la densité cellulaire. Ces méthodes sont souvent complétées par la sédimentation des globules rouges par dextran. Ces méthodes peuvent gérer de plus grandes échelles de matériau de départ et peuvent également atteindre une pureté élevée. Une mise en garde de l’isolement basé sur la densité est la séparation inefficace d’autres granulocytes beaucoup moins abondants (principalement des éosinophiles) des neutrophiles, et c’est donc la principale limitation du protocole présenté, car même la présence d’une contamination par de petites cellules peut affecter la réponse neutrophile24.
Présenté ici est une méthode résumée basée sur l’isolation de gradient, affinant les méthodesprécédentes 10,22. Nous utilisons la sous-estimation actuelle des spécificités des neutrophiles pour isoler de manière fiable les neutrophiles humains purs avec des plaquettes résiduelles et des globules rouges limités, empêchant ainsi l’activation des neutrophiles et la mort accélérée. L’étape la plus cruciale est la superposition du gradient, qui est beaucoup plus efficacement obtenue en ajoutant le milieu de gradient de densité sous le sang pour obtenir une interface nette. Un examen rapide de l’anneau PBMC et du gradient après centrifugation peut révéler une contamination possible, une activation et de faibles rendements. Lorsque vous travaillez avec une membrane de leucaphérèse ou un pelage bouffant, la dilution du sang est importante car une densité cellulaire excessive entraînerait une agrégation cellulaire, conduisant à des impuretés et à l’activation cellulaire. 
Ce protocole doit être complété dans les 2 heures pour assurer la fraîcheur cellulaire, et les étapes impliquant le milieu de gradient de densité, le dextran et la lyse doivent être effectuées immédiatement, car l’exposition à ces solutions peut altérer les neutrophiles. Avec ce protocole, le rendement attendu de neutrophiles est d’au moins ~ 10 millions / 10 mL de sang total et d’au moins ~ 60 millions / 10 mL de pelage bouffant. L’évaluation de la qualité de l’isolement doit se faire comme suit : les neutrophiles activés doivent être inférieurs à 10 %, la contamination lymphocytaire inférieure à 5 %, l’éosinophile minimal (même dispersion latérale mais population de dispersion vers l’avant plus faible) et la viabilité cellulaire doit être supérieure à 90 %. Une pureté plus faible peut résulter d’une superposition ou d’un stockage inadéquats du milieu de gradient de densité ou en raison de la qualité et de la fraîcheur du produit sanguin de départ.

Le système immunitaire inné est composé de nombreux types de cellules qui maintiennent l’homéostasie immunitaire et la clairance des agents pathogènes ainsi que de nombreuses autres fonctions physiologiques. Les neutrophiles constituent le plus grand réservoir de globules blancs dans la circulation humaine1. La plupart des neutrophiles matures sont stockés dans la moelle osseuse, qui est le site de génération de nouveaux neutrophiles, également appelés granulopoïèse. Dans la moelle osseuse, les progéniteurs granulocytaires sortent du cycle cellulaire et se différencient en phase terminale, acquérant leurs noyaux et granules segmentés caractéristiques2. Dans des conditions inflammatoires, en réponse aux chimiokines, aux cytokines et aux modèles moléculaires associés aux dommages et aux agents pathogènes, les neutrophiles sont mobilisés de la circulation sanguine et de la moelle osseuse pour remplir un large éventail de fonctions. Ceux-ci comprennent la sécrétion de cytokines, la phagocytose directe de l’agent pathogène, la libération d’espèces réactives de l’oxygène, la dégranulation des protéines antimicrobiennes et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles.
Les molécules utilisées par les neutrophiles pour combattre l’infection sont toxiques pour les microbes et l’hôte. Ainsi, la durée de vie et l’élimination correcte des neutrophiles vieillissants/mourants sont fortement régulées, et ils ont une durée de vie limitée en circulation (<48 h)3. En raison de cette courte survie, le corps humain produit en moyenne 100 milliards de nouveaux neutrophiles chaque jour pour maintenir l’homéostasie de la population4. La granulopoïèse d’urgence peut encore augmenter la libération de neutrophiles, matures et immatures, dans le sang lors de l’inflammation et de l’infection5. L’importance des neutrophiles dans la réponse immunitaire innée est soulignée par les patients atteints de neutropénie acquise ou congénitale, qui sont sensibles aux infections bactériennes et fongiques6.
De nombreux défis se posent lors de l’étude de la biologie des neutrophiles et de leur rôle dans la réponse immunitaire en raison de leur nature, y compris leur courte survie et leur contenu cytotoxique. Les lignées cellulaires de type neutrophile ont été couramment différenciées des cellules HL-60 de la leucémie promyélocytaire humaine et des cellules PLB-9857,8. Bien qu’elles puissent présenter une morphologie semblable à celle des neutrophiles et effectuer une chimiotaxie, ces lignées cellulaires ne peuvent pas récapituler complètement la biologie des neutrophiles. Les essais in vitro utilisant ces lignées cellulaires sont également incapables de récapituler les expériences in vivo. En outre, la différenciation de ces cellules doit être induite et pourrait être affectée négativement par la manipulation des gènes avant la différenciation.
Récemment, des méthodes ont été développées pour contourner ces problèmes en utilisant des promoteurs inductibles pour moduler l’expression des gènes après différenciation dans les cellules HL-609. Même avec de tels outils, les PMN humaines primaires sont nécessaires pour valider les cibles à l’aide d’approches pharmacologiques. Ainsi, il est impératif d’obtenir des neutrophiles purs et inactivés isolés du sang pour valider les résultats de lignées cellulaires et de modèles animaux. Cet article présente un protocole d’isolement PMN révisé dans lequel les avantages et les inconvénients des méthodes actuelles ont été évalués10. Une combinaison a été conçue comprenant une centrifugation par gradient pour séparer les PMN des autres cellules immunitaires, une sédimentation courte à base de dextran pour éliminer la majeure partie des globules rouges, une lyse rapide des globules rouges résiduels par pression osmotique et une centrifugation à basse vitesse pour éliminer la contamination plaquettaire.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique à 3 % avec</td><td>technologies de cellules souches</td> de bleu de méthylène<td>#07060</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT</td><td>invitrogen</td><td>A24858</td><td>Analyseur FACS</td></tr><tr><td>Cd11b-PE</td><td>biolegend</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>CD14-BV421</td><td>biolegend</td><td>367144</td><td></td></tr><tr><td>CD193-BV605</td><td>biolegend</td><td>310716</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PerCP</td><td>biolegend</td><td></td><td></td>302228</tr><tr><td>CD3-PerCP</td><td>biolegend</td><td>300326</td><td></td></tr><tr><td>CD41-APC</td><td>biolegend</td><td>303710</td><td></td></tr><tr><td>Cd45-APC</td><td>biolegend</td><td>103111</td><td></td></tr><tr><td>CD62L-PE</td><td></td><td>biolegend 304802</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-FITC</td><td>biolegend</td><td>305103</td> Centrifugeuse 5810R <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>22625101</td><td>centrifugeuse</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Fisher</td><td>BP1580</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>R& D systèmes S11150H</td><td></td><td>l’inactivation du complément FBS est recommandée</td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Hanks solution saline équilibrée (-CaCl2), (-MgCl2) (-MgSO4)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>HBSS sans Ca2+/Mg2+ est conseillé. car il a été démontré qu’ils conduisent à l’activation de neutrohpil</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell technologies</td><td>#07801</td><td>gradient de densité moyen</td></tr><tr><td>MACSxpress Kit d’isolement des neutrophiles du sang total, humain</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-434</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>eau ultra-pure</td><td>KD medical</td><td>RGF-3410</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Les neutrophiles (PMN) sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation humaine, allant de 40 à 70% des leucocytes sanguins totaux. Ce sont les premières cellules recrutées sur le site de l’inflammation via une extravasation rapide à travers les vaisseaux. Là, les neutrophiles remplissent un éventail de fonctions pour tuer les agents pathogènes envahisseurs et médier la signalisation immunitaire. Les neutrophiles fraîchement purifiés du sang humain sont le modèle de choix pour l’étude, car aucune lignée cellulaire ne reproduit complètement les fonctions et la biologie des PMN. Cependant, les neutrophiles sont des cellules à courte durée de vie, différenciées en phase terminale et sont très sensibles à l’activation en réponse à des stimuli physiques (température, vitesse de centrifugation) et biologiques (endotoxines, chimio et cytokines). Par conséquent, il est crucial de suivre une méthode standardisée, fiable et rapide pour obtenir des cellules pures et non activées. Ce protocole présente un protocole mis à jour combinant la centrifugation par gradient de densité, la sédimentation des globules rouges (GLOBULES ROUGES) et la lyse des globules rouges pour obtenir une pureté élevée de PMN et minimiser l’activation cellulaire. En outre, les méthodes d’évaluation de la qualité, de la viabilité et de la pureté de l’isolement des neutrophiles sont également discutées.

Lors de l’utilisation du gradient de densité pour purifier les neutrophiles, il est essentiel que l’interface entre le sang et le milieu de gradient de densité soit aussi nette que possible et qu’une séparation distincte des couches reste après la centrifugation (étape 1.4). Après la lyse des globules rouges, le tampon doit être rouge clair et non trouble (étape 3.3). Si la préparation est trouble, une deuxième série de lyse (étape 3) peut être nécessaire, bien que cela puisse affecter la survie des neutrophiles (Figure 1). Après la lyse, une centrifugation à basse vitesse (200 × g)est recommandée lorsque la pureté est priorisée, car elle réduit considérablement la contamination plaquettaire. Cependant, la centrifugation à grande vitesse (400 × g)augmente le rendement au détriment de la pureté (étape 3.4, Figure 2). Après l’isolement des neutrophiles, le tri cellulaire activé par fluorescence peut être utilisé pour évaluer la pureté de l’isolement (étape 4.1) et doit être choisi plutôt que la microscopie. Bien que la distribution FSC/SSC des cellules fournisse à elle seule une estimation de la qualité de l’isolement cellulaire(figure 3A),l’utilisation de marqueurs cellulaires spécifiques devrait être préférée. Dans ce cas, les populations cellulaires contaminantes les plus courantes sont colorées avec des anticorps spécifiques avec CD66b, spécifiquement exprimés sur les granulocytes. La coloration CD45 est utilisée pour distinguer les leucocytes (CD45+) et les globules rouges et les plaquettes (CD45-).
Les autres contaminants comprennent les lymphocytes (CD3+ ou CD19+, Figure 3F),les monocytes (CD14+, Figure 3D)et les éosinophiles (CD193+, Figure 3G). CD11b est une intégrine exprimée sur la lignée myéloïde; les neutrophiles et les monocytes sont CD11b+, tandis que les lymphocytes sont CD11b-(Figure 3C). Comme l’activation des neutrophiles peut affecter les expériences en aval, l’expression de CD62L doit être évaluée; les neutrophiles deviennent CD62L- une fois activés (étape 4.1). Le peptide fMLP peut être utilisé comme témoin positif de l’excrétion de CD62L (Figure 4). Il est également important d’évaluer la santé des neutrophiles avant d’effectuer des tests; les neutrophiles ont une demi-vie relativement courte et l’activation peut encore la raccourcir (étape 4.2). Une coloration standard de l’annexe V et de l’IP peut donner des informations sur l’état vivant/mort de la culture de neutrophiles à des moments désignés (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig01.jpg"> Figure 1: Séparation des granulocytes par gradient de densité. (A) Avant et (B) après centrifugation. Notez l’interface nette entre le sang et les couches moyennes de gradient de densité. (C) Sédimentation de la pastille en B remise ensse (1:1) en 5 % FBS/HBSS et 3 % Dextran-0,9 % NaCl. (D) Pastille de PMN après lyse des globules rouges résiduels dans le surnageant de (C) avec H2O. Abréviations: PBMC = cellule mononucléaire du sang périphérique; PMN = neutrophile; RBC = globules rouges; FBS = sérum bovin fœtal; HBSS = Solution saline équilibrée de Hank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig02.jpg"> Figure 2: La rotation à des vitesses plus faibles après la lyse RBC a réduit la contamination plaquettaire. Après lyse des globules rouges avecH2O, les cellules ont été filées à 200 × g (A)ou 400 × g (B). Les neutrophiles ont été colorés et une analyse de cytométrie en flux a été effectuée, comme décrit à la figure 3,avec l’ajout d’anti-CD41 pour étiqueter les plaquettes. Abréviations : RBC = globules rouges; CD41 = groupe de différenciation 41; SSC-A = zone de dispersion latérale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig03.jpg"> Figure 3: Évaluation des neutrophiles isolés du pelage bouffant. Les neutrophiles isolés ont été colorés avec des anti-CD66b, anti-CD11b, anti-CD14 et anti-CD193 selon un protocole standard. Les cellules individuelles (B) ont été fermées à partir des cellules totales (A). (C) Les cellules CD11b+ ont été fermées à partir de cellules individuelles. (D) Diagramme à points montrant les neutrophiles (CD66b+, CD14 faible/-) et une très faible contamination des monocytes (CD66b-, CD14+, Q1). (E) Les cellules CD66b- et CD66b+ ont été fermées. (F) CD66b- les cellules étaient positives pour les marqueurs lymphocytaires (CD3, CD19). (G) Expression de CD11b et CD193 dans les cellules CD66b+, montrant des populations distinctes de neutrophiles (CD66b+,CD11b+,CD193-) et d’éosinophiles (CD66b+,CD11b-, CD193+). Dans le résultat représentatif présenté ici, la pureté des neutrophiles est d’environ 93% avec ~ 3,7% de lymphocytes et ~ 3,7% de contamination par les éosinophiles. (H) Quantification de la pureté des neutrophiles après purification. Les données sont compilées à partir de 5 essais individuels et présentées comme moyennes ± SD. Abréviations: CD = cluster de différenciation; SSC-A = SSC-A = zone de dispersion latérale; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig04.jpg"> Figure 4: La purification par gradient n’a pas provoqué d’excrétion de CD62L. (A-B) Les neutrophiles témoins (A) ou stimulés par fMLP (B) (1 mM fMLP pendant 15 min à 37 °C) ont été colorés avec des marqueurs de neutrophiles et CD62L. (C) L’intensité moyenne fluorescente pour CD62L est diminuée dans les cellules traitées fMLP, ce qui indique une excrétion de CD62L et une activation des neutrophiles. Abréviations: CD26L = L-selectin; fMLP = N-Formylméthionyl-leucyl-phénylalanine; SSC-A = SSC-A = zone de dispersion latérale; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant; PE = phycoérythrine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62837/62837fig05.jpg"> Figure 5: Mort spontanée des neutrophiles purifiés par gradient de densité ou kit d’isolement des neutrophiles. Les neutrophiles ont été purifiés avec un gradient de densité(A et B)ou des microbilles commerciales(C et D)et cultivés pendant 0 h(A et C)ou 24 h(B et D)dans RPMI-10% FCS. Les cellules ont été colorées à l’aide de l’annexine V et de l’IP à des moments respectifs selon un protocole standard. (E) Quantification de la mort spontanée des neutrophiles purifiés. n=5, moyenne ± SD. Abréviations: SSC-A = SSC-A = zone de dispersion latérale; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant; PI = iodure de propidium; FCS = sérum de veau fœtal; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; AV5 = Annexe V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62837/62837fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...

Les neutrophiles sont des cellules différenciées en phase terminale, et il n’existe actuellement aucune lignée cellulaire pour récapituler complètement la biologie des neutrophiles. Ainsi, il est nécessaire d’obtenir des neutrophiles purs, inactivés, sains et frais pour étudier leur biologie. Cette méthode de rafraîchissement combine gradient de densité, sédimentation, lyse douce pour obtenir une préparation neutrophile pure.Il est facile à mettre en place, nécessite un équipement simple et peu de pratique. L’aspect technique, tel que la superposition de dégradés, de cette méthode nécessitera une certaine pratique à maîtriser, mais une fois le dégradé perfectionné, les autres étapes devraient venir comme un jeu d’enfant. Commencez par stériliser le manteau bouffi, l’emballage et la capuche laminaire.Ajoutez ensuite 10 millilitres de sang dans un tube de 50 millilitres. Pour diluer le sang pour un nettoyage du gradient, ajoutez 5% FBS / HBSS et composez le volume jusqu’à 35 millilitres. Après avoir fermé le couvercle, inverser le tube plusieurs fois pour le mélanger, puis garder le tube à l’envers pour obtenir le fond dépourvu de globules rouges.Ajouter 10 millilitres du milieu de gradient de densité directement sous le sang, en veillant à ce que le milieu et le sang ne se mélangent pas et que l’interface reste nette. Faites tourner le tube à 400 g pendant 30 minutes à température ambiante, en veillant à désactiver le frein. Après la filature, observez le gradient séparé en une couche de plasma sérique supérieure, un anneau blanc moyen de cellules mononucléaires du sang périphérique, une couche moyenne de gradient de densité trouble et une pastille inférieure constituée d’une fine bande de neutrophiles blanches au-dessus des globules rouges.Pour éliminer le PBMC, faites sortir la pipette d’aspiration directement dans la couche de PBMC et aspirez complètement pendant que la couche de plasma sérique diminue à mesure que l’anneau est retiré. Grattez le côté du tube avec la pipette d’aspiration pour maximiser l’élimination du PBMC. Retirez soigneusement la couche de milieu de gradient de densité trouble entre l’anneau PBMC et la pastille de neutrophile/RBC.Pour la sédimentation érythrocytaire, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la pastille de neutrophiles/globules croisés dans un tube propre. Ajoutez ensuite 5 % de FBS/HBSS à un volume final de 25 millilitres. Ajouter directement 25 millilitres de la solution préwarmée contenant 3% dextran/0,9% DeCl dans l’eau dans le tube et mélanger doucement par inversion.Placez le tube sur une surface nivelée et non vibrante pendant 15 minutes. Après avoir remis le tube dans la hotte, immergez légèrement la pipette dans le liquide et collectez environ 30 millilitres de la couche supérieure en suivant la surface du liquide vers le bas. Faites tourner le tube pour obtenir une pastille rouge sans particules flottantes dans le milieu.Pour la lyse des globules droits résiduels, aspirer doucement le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter 25 millimètres d’eau ultrapure stérile directement dans le tube et mélanger doucement en inversant le tube pendant 28 secondes pour lyser le GLOBULER. Ensuite, ajoutez immédiatement 25 millilitres de solution stérile de NaCl à 1,8% préparée dans l’eau dans le tube et ramenez la solution aux conditions isotoniques par mélange doux.Faire tourner le tube à 200 fois g pendant trois à cinq minutes avec un frein bas pour minimiser la sédimentation des globules anneaux et des plaquettes avec les neutrophiles. Pour la réutilisation de la pastille de neutrophile blanc, ajoutez directement le milieu de culture sur la pastille, mais ne pipetez pas de haut en bas. Ensuite, bercez le tube horizontalement d’un côté à l’autre pour minimiser l’activation des cellules.Si une agrégation ou un agglutination cellulaire est observé, filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage de 70 micromètres pour éliminer les neutrophiles agglomérés. Pour évaluer la qualité de la préparation de neutrophiles isolés, colorez les cellules avec des marqueurs spécifiques aux neutrophiles, aux éosinophiles et à un marqueur d’activation. Après avoir acquis 20 000 cellules par cytométrie en flux, analysez la pureté et l’activation des cellules à l’aide des stratégies de contrôle et déterminez la viabilité cellulaire à l’aide de l’annexine V / iodure de propidium comme décrit dans le manuscrit du texte.Le gradient de densité à faible vitesse a donné des neutrophiles avec plus de pureté, tandis qu’une vitesse élevée a entraîné une augmentation du rendement au détriment de la pureté. En utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence, la distribution cellulaire seule a fourni une estimation de la qualité de l’isolement cellulaire, mais l’utilisation de marqueurs cellulaires spécifiques devrait être préférée. Les populations cellulaires contaminantes identifiées étaient des monocytes, des lymphocytes et des éosinophiles.L’énorme rendement en neutrophiles a été obtenu en utilisant ce protocole. L’expression de CD62L a été évaluée. L’intensité fluorescente moyenne pour CD62L a diminué dans les cellules témoins positives, ce qui indique une excrétion de CD62L et une activation des neutrophiles.La santé des neutrophiles doit être évaluée avant d’effectuer le test, car les neutrophiles ont une demi-vie relativement courte et l’activation raccourcit encore la durée de vie. Après purification des neutrophiles à l’aide du gradient de densité et des microbilles commerciales, les cellules ont été cultivées pendant 24 heures et la survie cellulaire a été analysée par cytométrie en flux. La quantification des cellules viables a indiqué que la purification du gradient de densité a donné lieu à plus de cellules viables après 24 heures qu’à la purification à l’aide d’un kit.Il est important que les étapes de superposition de gradient et de centrifugation soient effectuées aussi bien que possible, car cela aura un impact considérable sur la qualité de la préparation. Des expériences in vitro et des tests biochimiques peuvent être effectués en suivant cette procédure. En outre, une sélection négative pourrait être effectuée si des cellules ultrapures sont nécessaires, comme dans les expériences d’expression de cytokines et de protéines.

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JoVE Journal

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Biologie

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