Name: Le séquençage par insertion de transposons comme outil pour élucider les facteurs de colonisation bactérienne dans un symbiote Burkholderia gladioli de coléoptères Lagria villosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez la mutagenèse par transposon pour identifier les gènes essentiels à la colonisation d'insectes par Burkholderia gladioli. Cette méthode révèle les facteurs génétiques des symbioses bactériennes.

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Nous sommes reconnaissants à Junbeom Lee d’avoir fourni la souche E. coli WM3064+pRL27 pour la conjugaison et les conseils dans la procédure, à Kathrin Hüffmeier pour avoir aidé au dépannage lors de la génération de bibliothèques mutantes et au professeur André Rodrigues pour soutenir la collecte d’insectes et l’acquisition de permis. Nous remercions également Rebekka Janke et Dagmar Klebsch pour leur soutien dans la collecte et l’élevage des insectes. Nous reconnaissons les autorités brésiliennes pour l’octroi des permis suivants pour l’accès, la collecte et l’exportation de spécimens d’insectes : autorisation SISBIO n° 45742-1, 45742-7 et 45742-10, procédé CNPq nº 01300.004320/2014-21 et 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nr. 14BR016151DF et 20BR035212/DF). Cette recherche a été financée par les subventions de recherche FL1051/1-1 et KA2846/6-1 de la Fondation allemande pour la science (DFG).

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts relatif à l’étude.

Une bibliothèque de mutants transposon de B. gladioli a été générée pour identifier d’importants facteurs de colonisation de l’hôte dans l’interaction symbiotique entre les coléoptères L. villosa et les bactéries B. gladioli. Les principales étapes du protocole étaient la conjugaison, l’infection de l’hôte, la préparation de la bibliothèque d’ADN et le séquençage.
Comme de nombreuses souches de Burkholderia se prêtent à une modification génétique par conjugaison24,25, le plasmide transportant le transposon et la cassette d’insertion d’antibiotiques a été conjugué avec succès dans la souche cible B. gladioli Lv-StA d’E. coli. Les tentatives précédentes de transformation par électroporation ont donné très peu ou presque pas de transformants de B. glaïe oléoli. Il est conseillé d’optimiser la technique de transformation pour que l’organisme cible produise efficacement un grand nombre de transformants.
Un cycle de conjugaison et 40 points de conjugaison ont perturbé 3 736 gènes chez B. gladioli Lv-StA. Avec le recul, plusieurs cycles de conjugaison seraient nécessaires pour perturber la plupart des 7 468 gènes et obtenir une bibliothèque saturée. Notamment, le temps d’incubation pendant la conjugaison n’a pas été autorisé à dépasser 12-18 h, ce qui est la fin de la phase de croissance exponentielle de B. gladioli. Permettre la conjugaison au-delà de la phase de croissance exponentielle des cellules bactériennes réduit les chances de succès d’obtenir des transconjugants26. Par conséquent, la période de conjugaison doit être ajustée en fonction de la croissance des espèces bactériennes.
Pour mener à bien une expérience impliquant l’infection de bibliothèques mutantes chez un hôte, il est important d’évaluer la taille du goulot d’étranglement de la population bactérienne pendant la colonisation et la diversité des mutants dans la bibliothèque avantl’infection1,2,27. En préparation de l’expérience, nous avons estimé que le nombre minimum de coléoptères qui doivent être infectés a de fortes chances que chaque mutant de la bibliothèque soit échantillonné et autorisé à coloniser. Le temps approximatif de génération bactérienne in vivo et le nombre de générations pour la durée de l’expérience ont également été calculés. La culture in vitro a ensuite été cultivée jusqu’à un nombre comparable de générations en ajustant le temps d’incubation. Pour une expérience d’infection similaire chez d’autres hôtes non modèles, la capacité de maintenir une culture de laboratoire et une source constante des organismes hôtes est souhaitable.
Suite à la croissance de la bibliothèque mutante in vivo et in vitro et de la collecte d’échantillons, un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage d’insertion de transposons a été réalisé. La modification du protocole impliquait la conception d’amorces PCR personnalisées et l’ajout d’étapes PCR à sélectionner pour les fragments d’ADN contenant la cassette d’insertion. Étant donné que le protocole a été personnalisé, des cycles PCR supplémentaires dans le protocole ont augmenté le risque de suramplification et d’obtention de fragments d’adaptateur-adaptateur hybridés dans les bibliothèques finales. Par conséquent, une étape de nettoyage finale (sans sélection de taille) après les deux PCR est recommandée, car elle aide à éliminer ces fragments. La distribution de taille des bibliothèques d’ADN était encore plus large que prévu. Cependant, l’augmentation de la profondeur de séquençage a fourni suffisamment de données qui ont été filtrées lors de l’analyse bioinformatique, obtenant des résultats satisfaisants.
Comme la mutagénèse médiée par transposon génère des milliers d’insertions aléatoires en une seule expérience, il est possible de générer une bibliothèque saturée de mutants qui contient tous sauf ceux où les gènes essentiels à la croissance bactérienne ont été perturbés. Nous n’avons probablement pas travaillé avec une bibliothèque de mutants saturés, compte tenu des estimations de gènes essentiels dans d’autres études sur Burkholderia sp. 28,29. Une bibliothèque non saturée aide néanmoins à explorer divers gènes candidats pour d’autres études utilisant la mutagénèse ciblée. Avant les expériences, il est également important de rappeler que certains transposons ont des sites cibles d’insertion spécifiques qui augmentent l’abondance des mutants à certains loci du génome30. Les transposons mariner sont connus pour cibler les sites AT pour l’insertion31, et les transposons Tn5 ont un biais GC32,33. L’inclusion d’étapes au cours de l’analyse bioinformatique pour reconnaître les points chauds pour les insertions de transposons aidera à évaluer tout biais de distribution.
Bien que sujette à des revers, une expérience de séquençage d’insertion de transposon bien conçue peut être un outil puissant pour identifier de nombreux gènes conditionnellement importants chez les bactéries au sein d’une seule expérience. Par exemple, une douzaine de gènes de Burkholderia seminalis importants pour la suppression de la nécrose des feuilles d’orchidée ont été identifiés en combinant la mutagénèse des transposons et lagénomique 34. Au-delà de Burkholderia,plusieurs gènes et transporteurs d’adhésion et de motilité ont été identifiés comme des facteurs de colonisation importants chez les symbiotes Snodgrassella alvi d’Apis mellifera (Abeille)22, et dans les symbiotes Vibrio fischerii d’Euprymna scolopes (calmar bobtail hawaïen)23 en utilisant l’approche de mutagénèse par insertion de transposon.
Comme approche alternative, la mutagénèse transposon peut être suivie d’un dépistage des mutants individuels à l’aide de milieux sélectifs au lieu du séquençage. Un dépistage phénotypique ou des essais biologiques pour identifier les lacunes, telles que la motilité, la production de métabolites secondaires bioactifs ou d’auxotrophies spécifiques, sont réalisables. Par exemple, le criblage d’une bibliothèque de mutants de transposon Burkholderia insecticola (réaffectée au genre Caballeronia35)a été essentiel pour identifier que les symbiotes utilisent des gènes de motilité pour coloniser Riptortus pedestris,leur insecte hôte36. En outre, en utilisant la mutagénèse transposon et le criblage phénotypique, le groupe de gènes biosynthétiques pour le métabolite secondaire bioactif caryoynencine a été identifié dans Burkholderia caryophylli37. Un mutant auxotrophe de Burkholderia pseudomallei a été identifié à la suite d’une mutagénèse et d’un dépistage par transposon et est un candidat vaccin atténué possible contre la mélioïdose, une maladie dangereuse chez l’homme et l’animal38. Ainsi, la mutagénèse et le séquençage des transposons sont une approche précieuse dans l’étude des traits moléculaires des bactéries qui sont importants pour les interactions avec leurs hôtes respectifs dans des associations pathogènes ou mutualistes.

Burkholderia gladioli peut s’engager dans une association symbiotique avec les coléoptères Lagria villosa, jouant un rôle important dans la défense contre les antagonistes microbiens de l’insecte hôte4,5,6. Les coléoptères femelles abritent plusieurs souches de B. glaïeules dans des glandes spécialisées accessoires au système reproducteur. Lors de la ponte, les femelles étalent les cellules de B. gladioli à la surface de l’œuf où les composés antimicrobiens produits par B. gladioli inhibent les infections par les champignons entomopathogènes4,6. Au cours du développement embryonnaire tardif ou au début de l’éclosion des larves, les bactéries colonisent les invaginations cuticulaires sur la surface dorsale des larves. Malgré cette localisation spécialisée et cette voie de transmission verticale des symbiotes, L. villosa peut vraisemblablement aussi acquérir B. gladioli horizontalement de l’environnement4. De plus, au moins trois souches de B. gladioli ont été trouvées en association avec L. villosa4,6. Parmi ceux-ci, B. gladioli Lv-StA est le seul qui se prête à la culture in vitro.
B. glaïez Lv-StA a une taille de génome de 8,56 Mb6 et contient 7 468 gènes. Lesquels de ces gènes sont importants pour que la bactérie B. gladioli colonise l’hôte du coléoptère? Pour répondre à cette question, nous avons utilisé le séquençage par insertion de transposon (Tn-seq), une méthode exploratoire permettant d’identifier les gènes microbiens conditionnellement essentiels1,2,3. Une bibliothèque mutante de B. gladioli Lv-StA a été créée à l’aide d’un transposon Tn5. Par conjugaison des cellules donneuses d’Escherichia coli à B. gladioli Lv-StA, un plasmide pRL27 portant le transposon Tn5 et une cassette de résistance aux antibiotiques flanquée de répétitions inversées ont été transférés (Figure 1). Ainsi, un ensemble de mutants porteurs individuellement de perturbations de 3 736 gènes symbiotes a été généré (Figure 2).
Le groupe de mutants a été infecté sur des œufs de coléoptères pour identifier les facteurs de colonisation et, comme témoin, a également été cultivé in vitro dans le milieu B de King(KB). Après avoir prévu suffisamment de temps pour la colonisation, les larves écloses ont été collectées et mises en commun pour l’extraction de l’ADN. Des fragments d’ADN contenant l’insert de transposon et la région génomique d’accompagnement de B. gladioli Lv-StA ont été sélectionnés à l’aide d’un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage. Un traitement de qualité de lecture suivi d’une analyse avec DESeq2 a été effectué pour identifier des gènes spécifiques cruciaux pour que B. gladioli Lv-StA colonise les larves de L. villosa lorsqu’elles sont transmises par la surface de l’œuf.

<table><tbody><tr><td>2,6- Acide diaminopimélique</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22391</td><td>Pour E.coli WM3064+ pRL27</td></tr><tr><td>Agar - Agar</td><td>Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Perles AMPure XP (billes magnétiques + polyéthylène glycol + sels)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Sélection de la taille à l’étape 6.6</td></tr><tr><td>Eau de Javel (NaOCl) 12 %</td><td>Roth</td><td>9062</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2 v.2.4.2</td><td></td><td></td><td>Outil bioinfromatique pour la cartographie de lecture. Référence 10 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>Buffer-S</td><td>Peqlab</td><td>PEQL01-1020</td><td>Pour PCR</td></tr><tr><td>Racleur</td> cellulaire <td>Sarstedt</td><td>83.1830</td><td></td></tr><tr><td>Cutadapt v.2.10</td><td></td><td></td><td>Outil bioinformatique pour supprimer des séquences d’adaptateur spécifiques des lectures. Référence 8 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>Package DESeq2</td><td></td><td></td><td>RStudio pour l’évaluation de l’abondance différentielle des mutants. Généralement utilisé pour l’analyse RNAseq. Référence 12 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 100 pb</td><td>Roth</td><td>T834.1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0182</td><td>PCR pour confirmer le succès de la conjugaison</td></tr><tr><td>EDTA, sel di-sodique</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Kit complet de purification d’ADN et d’ARN</td><td>Lucigen</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>FastQC v.0.11.8</td><td></td><td></td><td>Outil bio-informatique d’évaluation de la qualité des données de séquençage. Référence 7 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>FeatureCounts v.2.0.1</td><td></td><td></td><td>Outil bioinformatique permettant d’obtenir le nombre de lectures par caractéristique génomique. Référence 11 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Roth</td><td>7530</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Serva</td><td>26899</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Roth</td><td>PO27</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina (jeu d’amorces d’indice 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de préparation de bibliothèque d’ADN pour Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td></td></tr><tr><td>Peptone (soja)</td><td>Roth</td><td>2365</td><td>Pour Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td></tr><tr><td>peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polymerase VWR</td><td></td><td>PEQL01-1020</td><td>PCR pour confirmer le succès de la conjugaison</td></tr><tr><td>Plaques de Petri - 145 x 20 mm</td><td>Roth</td><td>XH90.1</td><td>Pour la sélection des transconjugaiseurs</td></tr><tr><td>Plaques de Petri - 90 x 16 mm</td><td>Roth</td><td>N221.2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Allemagne)</td><td></td><td></td><td>Contrôle de qualité après préparation de la banque d’ADN</td></tr><tr><td>Perles de streptavidine</td><td>Roth</td><td>HP57.1</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase</td><td>VWR</td><td>01-1020</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic v.0.36</td><td></td><td></td><td>Outil bioinformatique pour le découpage des lectures de mauvaise qualité et des séquences adaptatrices. Référence 9 dans le manuscrit principal.</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Roth</td><td>9090.1</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>2366</td><td>Pour Escherichia coli WM3064+pRL27 LB</td></tr><tr><td>Moyen Ultrasonisateur</td><td>Bandelin</td><td>GM 70 HD</td><td>Pour le cisaillement</td></tr><tr><td>Enzyme USER (uracile ADN glycosylase + ADN glycosylase-lyase Endonuclease VIII)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td>Étape de ligature 6.5.2</td></tr><tr><td>Extrait</td> <td>de levureRoth</td><td>2363</td><td></td></tr></tbody></table>

le séquençage par insertion de transposons comme outil pour élucider les facteurs de colonisation bactérienne dans un symbiote burkholderia gladioli de coléoptères lagria villosa

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Déduire la fonction des gènes en manipulant leur activité est un outil essentiel pour comprendre les fondements génétiques de la plupart des processus biologiques. Les progrès de la microbiologie moléculaire ont vu l’émergence de diverses techniques de mutagénèse pour la manipulation des gènes. Parmi eux, le séquençage transposon-insertion (Tn-seq) est un outil précieux pour évaluer simultanément la fonctionnalité de nombreux gènes candidats de manière non ciblée. La technique a été essentielle pour identifier les mécanismes moléculaires de la colonisation des hôtes eucaryotes chez plusieurs microbes pathogènes et quelques symbiotes bénéfiques.
Ici, Tn-seq est établi comme une méthode pour identifier les facteurs de colonisation dans un symbiote mutualiste Burkholderia gladioli du coléoptère Lagria villosa. Par conjugaison, l’insertion par transposon Tn5 d’une cassette de résistance aux antibiotiques est réalisée à des endroits génomiques aléatoires chez B. gladioli. Pour identifier l’effet des perturbations génétiques sur la capacité des bactéries à coloniser l’hôte du coléoptère, la bibliothèque de mutations transposon de B. gladioli générée est inoculée sur les œufs du coléoptère, tandis qu’un témoin est cultivé in vitro dans un milieu de culture liquide. Après avoir prévu suffisamment de temps pour la colonisation, l’ADN est extrait des bibliothèques cultivées in vivo et in vitro. Suivant un protocole de préparation de bibliothèque d’ADN, les échantillons d’ADN sont préparés pour le séquençage d’insertion de transposon. Les fragments d’ADN qui contiennent le bord transposon-insert et l’ADN bactérien flanquant sont sélectionnés, et les sites de mutation sont déterminés par séquençage loin du bord transposon-insert. Enfin, en analysant et en comparant les fréquences de chaque mutant entre les bibliothèques in vivo et in vitro, l’importance de gènes symbiotes spécifiques lors de la colonisation du coléoptère peut être prédite.

Les bactéries associées à l’hôte peuvent utiliser plusieurs facteurs pour établir une association, y compris ceux qui médient l’adhésion, la motilité, la chimiotaxie, les réponses au stress ou des transporteurs spécifiques. Alors que des facteurs importants pour les interactions pathogène-hôte ont été rapportés pour plusieursbactéries13,14 , 15,16,17,18, y compris les membres du genre Burkholderia19,20, moins d’études ont exploré les mécanismes moléculaires utilisés par les symbiotes bénéfiques pour la colonisation21,22,23 . En utilisant le séquençage d’insertion de transposons, l’objectif était d’identifier les facteurs moléculaires qui permettent à B. gladioli de coloniser les coléoptères L. villosa.
La mutagénèse médiée par transposon a été réalisée à l’aide du plasmide pRL27, qui porte un transposon Tn5 et une cassette de résistance à la kanamycine flanquée de sites de répétition inversés. Le plasmide a été introduit dans les cellules cibles de B. gladioli Lv-StA par conjugaison avec la souche E. coli WM3064 du donneur de plasmide (comme le montre la figure 1). Après conjugaison, le mélange de conjugaison contenant des cellules donneuses de B. glaïe et d’E. coli a été plaqué sur des plaques de gélose sélectives contenant de la kanamycine. L’absence de DAP sur les plaques a éliminé les cellules d’E. coli donneuses, et la présence de kanamycine sélectionnée pour les transconjugants réussis de B. gladioli Lv-StA. La bibliothèque de mutants B. gladioli Lv-StA obtenue à partir de la récolte des 100 000 colonies transconjuvantes a été préparée pour le séquençage à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ADN modifié et d’amorces personnalisées. La figure 2 met en évidence les étapes de préparation de la bibliothèque d’ADN. Le séquençage a donné 4 millions de lectures appariées; 3 736 gènes sur 7 468 gènes de B. gladioli Lv-StA ont été perturbés.
Pour identifier les mutants qui étaient défectueux de colonisation chez l’hôte, la bibliothèque mutante B. gladioli Lv-StA a été infectée sur les œufs de coléoptères et cultivée in vitro en milieu KB comme témoin. La taille du goulot d’étranglement de la colonisation in vivo a été calculée avant l’expérience. Un nombre connu de cellules de B. gladioli Lv-StA a été infecté sur des œufs de coléoptères, et le nombre de cellules colonisatrices dans les larves du premier stade fraîchement écloses a été obtenu en plaquant une suspension de chaque larve et en comptant les unités formant des colonies par individu. Ces calculs ont été effectués pour s’assurer que le nombre de cellules colonisatrices est suffisant pour évaluer la totalité ou un pourcentage élevé des mutants de la bibliothèque pour leur capacité à coloniser l’hôte. De plus, le temps de croissance entre les conditions in vitro et in vivo a été normalisé en fonction du nombre de générations bactériennes pour rendre ces échantillons comparables.
Après l’éclosion des œufs, 1 296 larves ont été recueillies dans 13 bassins. Les cultures mutantes in vitro correspondantes ont été cultivées et stockées sous forme de stocks de glycérol. L’ADN des bibliothèques de mutants cultivés in vivo et in vitro a été extrait et fragmenté dans un ultrasonateur. La figure 3 montre la distribution granulométrique de l’ADN cisaillé, où la majorité des fragments s’étendent entre 100 et 400 pb, comme prévu. Cette étape a été suivie par le protocole de préparation de la bibliothèque d’ADN modifié pour le séquençage. À chaque étape du protocole, la concentration d’ADN restant a été vérifiée pour s’assurer que les étapes ont été effectuées correctement et pour suivre les pertes d’ADN. Un contrôle de qualité (voir la table des matériaux)avant le séquençage a révélé que les bibliothèques d’ADN contenaient des fragments d’ADN étonnamment grands (&gt;800 pb), ce qui était plus prononcé dans les bibliothèques in vivo. Compte tenu de la difficulté d’optimiser le regroupement de fragments dans les voies de séquençage, il était nécessaire d’augmenter la profondeur de séquençage à 10 Mio de lectures appariées dans les bibliothèques in vivo pour atteindre le nombre de lectures souhaité. L’analyse des résultats du séquençage a révélé qu’une moyenne de 4 Mio de lectures dans les bibliothèques in vivo et de 3,1 Mio de lectures dans les bibliothèques in vitro contenait le bord transposon à l’extrémité 5' de Read-1(tableau 9),ce qui était satisfaisant pour cette expérience. La distribution des 24 224 insertions uniques à travers le génome de B. gladioli dans la bibliothèque originale est illustrée à la figure 4. Une analyse réalisée à l’aide de DESeq2 a révélé que les abondances de 271 mutants étaient significativement différentes entre les conditions in vivo et in vitro. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figure 3: Gels d’agarose d’un mutant et bibliothèques d’ADN. ( A )Geld’agarose avec l’ADN non ciselé d’un mutant dans la voie x et une échelle de 1 kbp pour l’échelle. (B) Gel avec bibliothèque d’ADN cisaillé. Les tailles de bande de l’échelle dans la première voie sont indiquées sur le côté gauche. Les trois premières voies a, b et c contiennent des fragments d’ADN cisaillés des bibliothèques in vivo. Les voies d, e, f et g contiennent des fragments d’ADN cisaillés des bibliothèques in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figure 4: Emplacement des sites d’insertion uniques dans la bibliothèque originale à travers les quatre replicons du génome Lv-StA de Burkholderia gladioli. Chaque barre le long de l’axe des x est située sur un site d’insertion. La hauteur d’une barre le long de l’axe des y correspond au nombre de lectures associées à ce site. Notez que les deux chromosomes et les deux plasmides sont représentés en pleine longueur et ont donc des échelles différentes sur l’axe des x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">King’s B médium / agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (soja)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agar-agar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Dissous dans de l’eau distillée</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">LB moyen/agar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryptone</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extrait de levure</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Dissous dans de l’eau distillée</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Composantes des médias.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Non.</td>
			<td>Amorces</td>
			<td colspan="2">Séquence</td>
			<td>Température de recuit PAR PCR (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17–1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13–2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Amorces pour confirmer le succès de la conjugaison.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau purifiée hpLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (haute spécificité)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total Mastermix</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modèle</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Mélange maître PCR pour confirmer le succès de la conjugaison. Abréviations : CLHP = chromatographie liquide à haute performance; dNTPs = désoxynucléoside triphosphate.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Escalier</td>
			<td>Température °C</td>
			<td>Heure</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation initiale</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Recuit</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 à 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Prolongation finale</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenir</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Conditions de PCR pour confirmer le succès de la conjugaison.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amorces</td>
			<td colspan="2">Séquence</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Utiliser</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apprêt biotinylé spécifique au transposon</td>
			<td colspan="2">5'-Biotine-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Coutume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce PCR universelle modifiée</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Coutume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Introduction à l’indice</td>
			<td colspan="3">Reportez-vous au manuel du fabricant</td>
			<td>6.7.1. PCR I &amp; 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Ensemble d’amorces d’indice 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptateur</td>
			<td colspan="3">Reportez-vous au manuel du fabricant</td>
			<td>6.5. Ligature de l’adaptateur</td>
			<td>Kit de préparation de la bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II pour Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : Amorces et adaptateur pour pcR I et II pendant la préparation de la bibliothèque d’ADN. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mélange PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fragments d’ADN ligaturés par adaptateur</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mélange maître NEBNext Ultra II Q5</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce d’indice (10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apprêt biotinylé spécifique au transposon (10 pmol/μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 6 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Mélange maître PCR I.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Escalier</td>
			<td>Température</td>
			<td>Heure</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation initiale</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 à 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recuit</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prolongation finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tenir</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 7 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Conditions pcR I et II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mélange PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADN sélectionné par perles</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mélange maître NEBNext Ultra II Q5</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Introduction à l’indice</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amorce PCR universelle modifiée</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 8 : Préparation de la bibliothèque d’ADN -Mélange maître PCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bibliothèques</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Bibliothèque originale</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Non. nombre de lectures (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Non. de lectures contenant Tn – bord à l’extrémité 5' de Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taux d’alignement global de Bowtie2 (%) (lecture 1 uniquement)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nombre d’insertions uniques</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Nombre de gènes touchés</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 9 : Résumé de la sortie de séquençage et de la fréquence d’insertion des transposons par bibliothèque. Abréviation : PE = paired-end.

Il s’agit d’une méthode adaptée pour identifier les facteurs de colonisation des insectes candidats dans un symbiote bénéfique Burkholderia. L’hôte du coléoptère est infecté par une bibliothèque mutante aléatoire générée par mutagénèse par transposon, et la complexité de la bibliothèque après la colonisation est comparée à un témoin cultivé in vitro.

Le séquençage par insertion de transposons comme outil pour élucider les facteurs de colonisation bactérienne dans un symbiote Burkholderia gladioli de coléoptères Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Ce protocole est utile pour effectuer des manipulations génétiques sur des bactéries symbiotiques, dans ce cas, en particulier sur Burkholderia, et identifier les gènes essentiels à la colonisation d’un insecte hôte. Le séquençage d’insertion de transposons est un outil puissant pour identifier simultanément un grand nombre de gènes conditionnellement essentiels dans une seule expérience. Commencez par inoculer une nouvelle culture de donneur d’E. coli dans 10 millilitres de milieu LB complété par de la kanamycine et du DAP sous une hotte stérile.Cellules receveuses inoculées de burkholderia glaïe A dans cinq millilitres de milieu KB. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker à 250 RPM. Après une croissance nocturne, centrifuger quatre millilitres de chacune des cultures à 9 600 fois G pendant six minutes pour granuler les cellules et éliminer le surnageant.Sous une hotte stérile, laver les cultures cellulaires en granulés dans un milieu KB contenant du DAP. Et enfin, resuspendez les cultures séparément en quatre millilitres de KB plus DAP medium. Dans un tube frais de 15 millilitres, mélanger 250 microlitres de cellules donneuses d’E. coli lavées avec un millilitre de cellules receveuses de glaïelet Burkholderia lavées.Repérez 10 microlitres de ce mélange de cellules de conjugaison sur des plaques de gélose KB contenant du DAP. Laissez la plaque reposer sans être dérangée dans la hotte stérile à température ambiante pendant une heure. Incuber les plaques avec les taches de conjugaison à 30 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures.Après l’incubation, ajoutez deux à quatre millilitres de 1X PBS sur les plaques sous une hotte stérile et utilisez un grattoir cellulaire pour libérer les points de conjugaison bactérienne cultivés de la gélose. Ensuite, pipetez le mélange de cellules conjuguées dans deux tubes de microfuge millilitres. Ar coupez les cellules en les centrifugant à 9 600 fois G pendant deux minutes.Jetez le surnageant et lavez la pastille deux fois dans un millilitre de 1X PBS en pipetant de haut en bas. Resuspendez la pastille finale en 1 200 microlitres de 1X PBS. Bien mélanger et étaler 100 microlitres du mélange cellulaire sur de grandes plaques de gélose KB complétées par de la kanamycine et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit.Compter le nombre total de colonies transconjugantes sur les trois plaques et extrapoler pour calculer le nombre approximatif de mutants obtenus dans toutes les plaques. Pour augmenter les chances d’obtenir une bibliothèque représentative, assurez-vous que le nombre total de colonies est plusieurs fois plus élevé que le nombre total de gènes dans le génome. Pour confirmer le succès de la conjugaison, effectuez une PCR ciblant la cassette d’insertion en utilisant 10 à 20 colonies d’échantillons comme décrit dans le manuscrit.Sous une hotte stérile, grattez les colonies des plaques en ajoutant un à deux millilitres de PBS 1X sur la gélose. Regrouper le mélange de cellules gratté des plaques dans des tubes de 50 millilitres. Vortex la bibliothèque pour bien mélanger, puis diviser un millilitre de la bibliothèque mutante regroupée en plusieurs tubes cryogéniques.Ajouter un millilitre de glycérol à 70% aux tubes et conserver à moins 80 degrés Celsius. Sélectionnez une couvée d’œufs L.villosa et comptez le nombre d’œufs qui continuent si la couvée contient plus de 100 œufs. Pour stériliser toute la couvée, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70% et lavez doucement les œufs pendant cinq minutes, puis retirez l’éthanol et lavez les œufs deux fois avec de l’eau autoclavée.Ajouter 200 microlitres d’eau de Javel à 12% et laver doucement les œufs pendant 30 secondes. Retirez immédiatement l’eau de Javel et lavez à nouveau les œufs trois fois avec 200 microlitres d’eau autoclavée. Infecter les œufs dans la couvée stérilisée en utilisant deux fois 10 à six cellules par microlitre de la bibliothèque mutante lavée dans PBS.Deux jours après l’éclosion des larves de coléoptères infectées, recueillir 100 larves d’instar de seconde par tube de microfuge de 1,5 millilitre et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour générer la bibliothèque de contrôle in vitro, inoculer 250 microlitres de deux fois 10 aux six cellules par microlitre de la bibliothèque mutante dans 10 millilitres de milieu KB contenant de la kanamycine. Après avoir extrait l’ADN des bibliothèques de mutants cultivées in vivo et in vitro, partagez l’ADN avec un ultrasonateur.Pour vérifier si l’ADN a été cisaillé à la plage de taille souhaitée, chargez cinq microlitres de l’ADN non cisaillement et cisaillé après mélange avec un colorant à chargement de gel dans un rapport de un pour un sur un gel d’agarose à 1,6% à 250 volts pendant 40 minutes. Pour préparer les extrémités de fragment nécessaires à la ligature de l’adaptateur, commencez par ajouter trois microlitres du mélange enzymatique et sept microlitres de tampon de réaction à 50 microlitres de l’ADN cisaillé et mélangez bien par pipetage. Réglez un thermocycleur avec un couvercle chauffé à plus ou égal à 75 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius et 30 minutes à 65 degrés Celsius, puis maintenez la température à quatre degrés Celsius.Pour la ligature de l’adaptateur, ajoutez 30 microlitres de mélange maître de ligature, un microlitre d’amplificateur de ligature et 2,5 microlitres d’adaptateur dilué aux produits de l’étape de préparation finale. Bien mélanger en pipetant et incuber l’échantillon pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius dans le thermocycleur avec le couvercle chauffé enlevé. Après 15 minutes, ajoutez trois microlitres de l’enzyme.Bien mélanger en pipetant et incuber l’échantillon pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur avec le couvercle chauffé à plus ou égal à 47 degrés Celsius. Pour sélectionner la taille de l’ADN ligaturé de l’adaptateur ciblant des fragments de 250 paires de bases, commencez par vortexer la solution de billes magnétiques et placez-la à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Ajouter 0,3 fois de perles à 96,5 microlitres du mélange d’ADN ligaturé et mélanger en pipetant soigneusement.Incuber le mélange de perles pendant cinq minutes. Placez les tubes sur un support magnétique pour tirer les perles vers le bas et enlever les fragments d’ADN de taille indésirable. Laissez les perles se déposer pendant cinq minutes, puis transférez le surnageant clair dans un nouveau tube de microfuge.Ajouter 0,15 fois de perles fraîches au surnageant et mélanger en faisant bien pipeter. Incuber le mélange de billes pendant cinq minutes, puis placer les tubes sur un support magnétique pour tirer vers le bas les perles liées à l’ADN cible. Attendez cinq minutes, puis jetez le surnageant en gardant les perles.Avec les perles sur le support magnétique, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 80% fraîchement préparé et attendez 30 secondes avant de jeter l’éthanol sans déranger les perles. Retirez les tubes du support et ajoutez 17 microlitres de 0,1X TE ou Low TE, puis mélangez en pipetant 10 fois et incubez le mélange à température ambiante pendant deux minutes. Placez le tube sur le support magnétique et prenez 15 microlitres de l’ADN de taille sélectionnée pour la PCR-1.Vortex de perles de streptavidine et placez-les à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Prenez 32 microlitres de perles et lavez-les avec 500 microlitres de 1X liant et tampon de lavage. Ajouter 32 microlitres de tampon de liaison et de lavage 2X et resuspender les perles.À cela, ajoutez 32 microlitres des produits PCR-1 nettoyés. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Placez le mélange d’ADN de perle sur un support magnétique pendant deux minutes.Pipettez le surnageant car l’ADN marqué à la biotine contenant le bord d’insertion se lie à la streptavidine sur les perles. Lavez les perles avec 500 microlitres de liant 1X et tampon de lavage, puis lavez les perles avec 200 microlitres de Low TE. Ressuspendez les billes liées à l’ADN dans 17 microlitres de Low TE. L’ADN des bibliothèques de mutants in vivo et in vitro extraits et fragmentés dans un ultrasonateur a montré que la majorité des fragments s’étendent entre 100 et 400 paires de bases. L’emplacement des insertions médiées par transposon à travers les quatre replicons du génome A de burkholderia gladioli peut être observé dans la gousse.Un résumé de la sortie de séquençage et du nombre d’insertions uniques et de gènes touchés dans les trois bibliothèques répliquées in vivo et in vitro peut être observé dans le tableau. La chose importante à retenir est de calculer la taille du goulot d’étranglement de la population pendant la colonisation de l’hôte pour obtenir une représentation appropriée de la bibliothèque pendant l’infection. En outre, ajustez pour un nombre compatible de générations bactériennes in vitro et dans l’hôte.Après avoir généré la bibliothèque de mutants transposon, elle peut être filtrée sur des supports sélectifs pour récupérer les mutants en fonction des différences phénotypiques. Des gènes spécifiques importants pour une condition peuvent ainsi être identifiés.

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