Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions

Ce protocole utilise la microscopie à super-résolution, en particulier la microscopie à reconstruction optique stochastique directe, également connue sous le nom de dSTORM, pour contourner la limite de diffraction et visualiser les véhicules électriques avec une précision nanométrique en trois dimensions. Un avantage notable de dSTORM est sa capacité à visualiser directement les particules sous le niveau de diffraction de la lumière sans endommager les étapes qui modifient la nature biochimique de l’EV. De nombreux virus distincts sur le plan de l’évolution utilisent la signalisation EV, par conséquent, dSTORM peut être utilisé pour caractériser les VE pour les biomarqueurs et la progression de la maladie, ainsi que pour visualiser des particules virales individuelles, telles que le SARS-CoV2. Commencez par placer des vésicules extracellulaires purifiées par affinité, ou VE, sur des plaques à fond de verre, microslides et huit puits dans un volume total de 200 microlitres, et laissez-les adhérer à la surface pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Sans retirer la solution existante de la plaque à huit puits, fixez les véhicules électriques sur les plaques en ajoutant 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans 1X PBS à la solution contenant du VE dans chaque puits et laissez les plaques incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde et l’excès de solution à l’aide d’une micropipette pour ne pas déranger les véhicules électriques. Lavez le VE avec 1X PBS pour éliminer l’excès de paraformaldéhyde.

Effectuez la procédure de lavage trois fois. Retirez l’excès de 1X PBS. Préparer 250 microlitres de solution tampon dSTORM Bcubed par échantillon en créant une solution de dioxygénase protocatéchuique de cinq millimolaires diluée dans un tampon d’imagerie conformément au protocole du fabricant.

Ajouter 250 microlitres du tampon préparé à chaque puits selon le protocole du fabricant, et incuber les plaques pendant 20 minutes à température ambiante avant l’imagerie pour récupérer les molécules oxydantes. Les véhicules électriques peuvent être visualisés immédiatement ou stockés à quatre degrés Celsius pendant une semaine. Pour préparer les billes nécessaires à l’étalonnage du microscope à super-résolution, diluez des microsphères de 100 nanomètres à une concentration de 0,5% dans de l’eau de qualité de biologie moléculaire et pipettez 200 microlitres dans chaque puits d’une plaque à fond de verre, microslide et huit puits.

Laissez les perles se déposer dans les puits pendant une heure à température ambiante. Sans retirer la solution existante, ajouter 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS à chaque puits de la solution de billes d’étalonnage, et laisser incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde avec une micropipette pour ne pas déranger les perles et lavez les perles trois fois avec 1X PBS.

Préparez le tampon comme décrit dans le manuscrit. Retirez 1X PBS et ajoutez 250 microlitres du tampon préparé à chaque puits. Laissez la mémoire tampon reposer pendant 20 minutes avant la visualisation.

Utilisez le bouton Connecter le microscope pour vous connecter au microscope 3D avant de placer quoi que ce soit sur la scène. Ajoutez de l’huile 100X à l’objectif et placez le centre du puits au-dessus de l’objectif. Dans le paramètre Acquérir, allumez les lasers d’excitation de 473 et 640 nanomètres et cliquez sur Afficher.

Sans activer l’objectif 3D, visualisez les perles sous le paramètre de saturation des photons en cliquant sur Nombre de photons dans les options d’affichage de l’image. Réglez les puissances laser initiales à 8,4 milliwatts pour le laser de 473 nanomètres et à 11,6 milliwatts pour le laser de 640 nanomètres. Diminuez la mise au point du laser à environ moins 300 nanomètres ou le plan focal des perles d’étalonnage pour produire une résolution claire des perles individuelles.

Une fois le plan Z mis au point, ajustez davantage les niveaux de puissance laser pour tenir compte de la variation dans chaque champ de vision. Sous les fonctions Instrument, effectuez l’étalonnage de la cartographie 3D et l’étalonnage de la cartographie des canaux pour obtenir les erreurs sur les axes X, Y et Z. définissez le nombre maximal de champs de vision sur 20, le nombre cible de points sur 4 000, la distance maximale entre les canaux sur 5,0 pixels et le rayon d’exclusion entre les canaux sur 10,0 pixels lors de l’étalonnage du mappage des canaux.

Assurez-vous que l’étalonnage produit une couverture de points supérieure à 90 % et une qualité de cartographie bonne. Enregistrez les données d’étalonnage données pour de futures acquisitions d’images. Ajoutez de l’huile 100X sur l’objectif et placez les véhicules électriques préparés sur le microscope.

Sans activer la lentille 3D, allumez le laser d’excitation de 640 nanomètres et augmentez-le initialement entre 1,2 et 12,5 milliwatts, en fonction de l’intensité du signal dans le champ de vision pour exciter la membrane rouge, en intercalant les véhicules électriques colorés par colorant. Sous Options d’affichage de l’image, passez de la saturation des photons aux percentiles pour mieux visualiser les véhicules électriques. Ajustez la puissance du laser pour minimiser le bruit tout en maximisant le signal et maintenez tous les autres paramètres.

Ajustez la mise au point du plan Z en cliquant sur l’icône haut ou bas sur l’axe Z. Réglez le temps d’exposition à 20 millisecondes, la capture d’image à 10 000 images et la puissance laser initiale entre 1,2 et 12,5 milliwatts, en fonction de l’intensité du signal et du champ de vision. Activez l’objectif 3D à l’aide de l’icône et démarrez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir.

Tout au long du processus d’acquisition d’images, augmentez la puissance du laser de trois incréments de 10 toutes les 1000 images, soit suffisamment pour maintenir un rapport signal/bruit élevé. N’ajustez pas le plan Z pendant l’acquisition. Après l’acquisition de l’image, basculez vers la fenêtre d’affichage Analyser.

Effectuez une correction de dérive sur l’image non filtrée, puis activez les filtres. Ajustez le nombre de photons, la précision de localisation, les sigmas et l’indice de trame, comme mentionné dans le manuscrit. Superposez un outil de vue X, Y, Z-plane le long de l’axe X des véhicules électriques individuels à partir du champ de vision et exportez les fichiers csv individuels des événements de commutation de photos.

Coupez en deux des véhicules électriques individuels sur l’axe X et Y dans un champ de vision X par Y à l’aide d’un outil Histogramme de ligne, qui épingle les événements de commutation de photos dans des groupes de distance définis. Prenez des images de véhicules électriques uniques et enregistrez-les en tant que fichiers tif. Créez des vidéos 3D de véhicules électriques individuels à l’aide d’un outil de visualisation 3D et colorez en fonction de leur emplacement le long de l’axe Z.

Après l’étalonnage du microscope qui a produit une erreur moyenne de 16 nanomètres sur l’axe X, Y et 38 nanomètres sur l’axe Z, les véhicules électriques u20 purifiés ont été visualisés avec succès avec une résolution allant jusqu’à 20 nanomètres sur l’axe X, Y et 50 nanomètres le long de l’axe Z. Les véhicules électriques individuels visualisés par dSTORM dans des photos 3D commutées tout au long de l’exposition de 10 000 images à mesure que la puissance laser augmentait et étaient facilement apparentes dans l’image acquise. La correction d’image post-acquisition dans le plan Z, le nombre de photons, les sigmas et la précision de localisation de l’image reconstruite ont permis d’obtenir une résolution claire de l’EV en 3D.

L’EV n’a pris de photos que pendant les 7 000 premières images, comme le montre la légende dans le coin supérieur droit. L’histogramme confirme que la majorité des événements de commutation de photos se sont produits dans un rayon de 100 nanomètres, validant que le VE visualisé est un exosome et que l’isolement des VÉHICULES électriques de petit diamètre a réussi. L’analyse de la distribution de taille effectuée sur d’autres véhicules électriques tracés individuellement à l’aide de l’outil Histogramme de ligne et de l’outil Vue X, Y, plan Z a confirmé que la plupart des événements de commutation de photos se sont produits dans un rayon de 100 nanomètres du centre.

L’erreur le long de l’axe Z a été augmentée, produisant une image finale allongée de l’EV le long de l’axe axial. Les événements de commutation de photos n’ont pas été corrélés avec la taille des VE, ce qui démontre que la caractérisation basée sur dSTORM peut être utilisée pour les petits véhicules électriques comme les exosomes et les petits virus enveloppés de moins de 100 nanomètres de diamètre. Lors de l’exécution de dSTORM, il est important de ne pas oublier de régler la puissance laser initiale très faible et de l’augmenter lentement tout au long de l’acquisition de l’image afin d’éviter le photoblanchiment.

Depuis son développement, dSTORM a permis aux chercheurs de mieux comprendre la morphologie des structures subcellulaires qui étaient auparavant impossibles à visualiser en raison de la limite de diffraction de la microscopie optique typique.