Un dépistage comportemental des crises induites par la chaleur dans des modèles murins d’épilepsie
12 juillet 2021
Le but de la méthode est de dépister l’hyperthermie ou les crises induites par la chaleur dans des modèles murins. Le protocole décrit l’utilisation d’une chambre construite sur mesure avec une surveillance continue de la température corporelle pour déterminer si une température corporelle élevée entraîne des convulsions.
Les mutations GEFS+ provoquent des convulsions fébriles chez les patients. La capacité d’étudier les crises induites par l’hypothermie chez les souris GEFS+ nous permet d’examiner la relation entre des mutations spécifiques et le profil épileptique. Le régulateur de température numérique permet de régler le gradient de température dans le boîtier de chauffage de manière reproductible.
Ainsi, la température corporelle de la souris peut être augmentée à un rythme lent et régulier. Ce protocole peut être utilisé pour identifier des thérapies potentielles, telles que des médicaments ou des restrictions alimentaires, qui peuvent être utilisées pour réduire ou éliminer les convulsions fébriles. Pour insérer la sonde de température rectale dans la souris sans blessure, nous vous recommandons d’anesthésier brièvement la souris et de lubrifier la pointe de la sonde rectale.
Commencez par allumer la chambre de chauffage de la souris avec le bouton d’alimentation, puis appuyez sur le bouton de chauffage. À l’aide du clavier du régulateur de température numérique, réglez la température de la chambre chauffante à 50 degrés Celsius. Tapisser le sol de la chambre de chaleur avec de la literie en torchis.
Montez une caméra d’enregistrement vidéo devant la chambre de chaleur. Tapisser une boîte de Petri de 140 millimètres de diamètre avec d’épaisses couches de papier de soie et la placer sur de la glace pour servir de tampon de refroidissement. Pour le test de dépistage, assurez-vous que le poids corporel de la souris est de 15 grammes ou plus.
Avant de commencer la procédure, vérifiez que la souris est complètement anesthésiée avec un pincement d’orteil. Enduisez la pointe métallique de la sonde de température rectale d’un lubrifiant et insérez-la doucement dans la souris. Fixez la sonde rectale à la queue de la souris avec du ruban adhésif.
Placez la souris dans une nouvelle cage de récupération bordée de litière en torchis. Démarrez une minuterie et observez la souris pendant cinq minutes tout en surveillant la température corporelle centrale, jusqu’à ce que la souris se rétablisse complètement de l’anesthésie et que la température se stabilise à 35 à 36 degrés Celsius. Au bout de cinq minutes, notez la température corporelle de la souris comme la température corporelle initiale à zéro minute.
Transférez rapidement la souris sur le sol de la chambre chauffante préchauffée pour commencer l’essai expérimental. Une fois la souris placée dans la chambre de souris préchauffée, démarrez la caméra et le chronomètre, augmentez la température de la chambre de chauffage à intervalles réguliers, de sorte que la température corporelle de la souris augmente à un rythme de 25, 2,5 degrés Celsius par minute. Commencez à enregistrer la température corporelle de la souris à des intervalles d’une minute pendant toute la durée de l’expérience.
À 9,5 minutes, réglez la température de la chambre de chaleur à 55 degrés Celsius pour stabiliser la température de la chambre de chaleur à 55 degrés Celsius à la 10e minute. De même, atteignez une température stable de la chambre de chaleur à 60 degrés Celsius à la 20ème minute. Chaque essai de dépistage des crises dure 30 minutes.
Si la souris subit une crise, enregistrez la température corporelle de la souris pendant la crise, comme une température seuil de saisie. Prenez note des caractéristiques de comportement de saisie affichées par la souris, puis prenez rapidement la souris dans la chambre et placez-la sur le coussin de refroidissement. Si une souris ne subit pas de crises induites par la chaleur au cours de la période d’observation de 30 minutes ou si la température corporelle de la souris atteint 44 degrés Celsius, placez la souris sur le coussin de refroidissement.
Lorsque la température corporelle de la souris descend à 36 à 37 degrés Celsius, transférez la souris dans une cage de récupération. Pour retirer la sonde rectale de la souris, coupez soigneusement le ruban entre la queue de la souris et le fil de la sonde rectale. Essuyez et nettoyez l’extrémité métallique de la sonde rectale avec de l’éthanol à 70%.
Observez la souris jusqu’à ce qu’elle récupère avant de la renvoyer dans la cage de la maison. Continuez à surveiller l’état de la souris. Marquez la fin de l’essai expérimental.
Réinitialisez la température de la chambre chauffante de la souris à 50 degrés Celsius et laissez-la s’équilibrer avant le prochain essai. Dans le test de saisie de chaleur, la température corporelle moyenne des souris a été enregistrée chaque minute à l’aide du protocole de chauffage, et le taux de changement de la température corporelle au fil du temps a été évalué. Il n’y avait pas de différence dans le taux de changement de température corporelle entre les souris mutantes hétérozygotes et les souris de type sauvage, dans les antécédents génétiques respectifs.
Les groupes expérimentaux et témoins de souris ont montré un comportement différent lorsqu’ils étaient exposés à une augmentation périodique de la température corporelle. Toutes les souris mutantes hétérozygotes issues de la génétique 129X1 ou B6NJ présentaient des crises induites par la chaleur. Aucune des souris de type sauvage dans le fond enrichi 129X1 n’a connu de crises, tandis que seulement un tiers des souris du fond B6NJ sensible aux crises ont montré des convulsions.
Une température seuil de saisie moyenne de souris mutantes 129X1 n’était pas significativement différente de la température moyenne du seuil de crise observée chez les souris B6NJ. Un tiers des souris de type sauvage B6NJ qui présentaient des crises induites par la chaleur avaient une température seuil de crise significativement plus élevée que celle des souris mutantes hétérozygotes B6NJ. La gravité des crises a été mesurée à l’aide de l’échelle de Racine modifiée.
Le score maximal de Racine des souris mutantes hétérozygotes dans le fond enrichi 129X1 n’était pas significativement différent de celui des souris mutantes hétérozygotes dans le fond génétique B6NJ. Lors du réglage du protocole de chauffage, assurez-vous que la température corporelle de la souris n’augmente pas à un rythme supérieur à 25 degrés Celsius par minute, sinon cela peut être nocif pour la santé de l’animal. Il serait très cool de combiner le protocole de chauffage avec des enregistrements EEG simultanés, ce qui nous permettrait de corréler différents modèles d’activité cérébrale avec différents types de comportement épileptique.
Aperçu
Cette étude examine les effets de l'hyperthermie sur l'induction de crises convulsives chez des modèles murins, en se concentrant spécifiquement sur les mutations GEFS+. Une enceinte chauffante sur mesure est utilisée pour surveiller en continu la température corporelle et évaluer si des températures élevées déclenchent des crises épileptiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neurobiologie comportementale
- Recherche sur les crises convulsives
Contexte
- Les mutations associées au GEFS+ sont liées aux crises fébriles chez les patients.
- Les modèles murins du GEFS+ permettent d'examiner les effets spécifiques de mutations sur les profils de crises.
- La compréhension des crises induites par la chaleur peut orienter le développement de thérapies potentielles contre les crises fébriles.
Objectif de l'étude
- Évaluer la survenue de crises induites par l'hyperthermie chez des modèles murins.
- Déterminer la relation entre les mutations génétiques et la susceptibilité aux crises sous température élevée.
- Identifier des thérapies potentielles permettant d'atténuer les crises fébriles.
Méthodes utilisées
- Une enceinte thermique sur mesure permettant de surveiller la température corporelle de la souris pendant les essais expérimentaux.
- L'utilisation de modèles murins GEFS+ avec une attention portée au poids corporel et à l'anesthésie afin d'obtenir des mesures précises.
- Des gradients de température sont réglés pour augmenter progressivement la température corporelle afin d'évaluer les seuils de convulsions.
- Des observations visuelles et des évaluations comportementales durant une période d'essai de 30 minutes sont intégrées.
Résultats principaux
- Les crises induites par la chaleur variaient considérablement entre les souris mutantes hétérozygotes et les souris de type sauvage.
- Les températures moyennes de seuil de crise présentaient des profils distincts selon les fonds génétiques.
- Les caractéristiques du comportement convulsif ont été enregistrées, fournissant des informations sur les variations de réponse aux températures élevées.
Conclusions
- L'étude établit une méthodologie pour évaluer la susceptibilité aux crises liées à la température chez les modèles murins.
- Les résultats mettent en évidence les influences génétiques sur les seuils de crises et les comportements en conditions hyperthermiques.
- Les découvertes contribuent à la compréhension des mécanismes sous-jacents aux crises fébriles et pourraient orienter les approches thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une induction reproductible et contrôlée en température de crises déclenchées par la chaleur chez des modèles murins, soutenant la validation de cibles en recherche sur l'épilepsie. Elle offre un criblage comportemental quantitatif pour évaluer les facteurs génétiques modifiant la susceptibilité aux crises, aidant ainsi à réduire les risques précliniques des candidats thérapeutiques. Le test facilite l'évaluation précoce de composés pouvant moduler les seuils de crises fébriles, orientant les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans la découverte de médicaments du système nerveux central.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Étudie les relations génotype-phénotype dans les épilepsies liées à SCN1A en associant des mutations spécifiques à des phénotypes de crises induites par la chaleur.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles génétiques grâce à des mesures normalisées et quantifiables du seuil de crise.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en identifiant les contextes génétiques conférant une susceptibilité différentielle aux crises sous stress hyperthermique.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données similaires à une courbe dose-réponse en corrélant l'augmentation de la température corporelle avec le début des crises, permettant ainsi la détermination d'un seuil.
- Valeur opérationnelle : Fournit des réponses comportementales reproductibles et compatibles avec un débit élevé, destinées aux campagnes de criblage de composés.
- Préparation du test : Produit des métriques standardisées de gravité des crises grâce à une échelle de Racine modifiée, facilitant la comparabilité entre études.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Modélise la progression des crises fébriles humaines chez des souris GEFS+, permettant l'évaluation préclinique d'interventions modifiant l'évolution de la maladie.
- Utilité préclinique : Permet une progression ajustée au risque en identifiant des composés qui élèvent le seuil de crise ou réduisent la gravité des crises dans des modèles mutants.
- Alignement des biomarqueurs : Facilite la corrélation entre les seuils de crises thermiques et les modificateurs génétiques, orientant les stratégies de stratification des patients.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte de l'épilepsie, allant de la validation de la cible à l'optimisation du composé actif, jusqu'aux essais d'efficacité préclinique, en particulier pour les modulateurs du SNC de l'excitabilité neuronale.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les effets spécifiques des gènes sur le seuil de crise dans des paradigmes de défi thermique contrôlés.
- Écrantage : Fournit des métriques quantitatives et reproductibles du début des crises pour évaluer des bibliothèques de composés en vue d'une activité anticonvulsivante.
- Analytique : Fournit comme paramètres clés le seuil de température de crise et la gravité évaluée selon l'échelle de Racine, utilisés pour l'analyse dose-réponse et l'analyse d'engagement de cible.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes génétiques obtenues chez les modèles murins aux phénotypes humains de crises fébriles, soutenant une validation préclinique associée à des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée de défi thermique applicable à plusieurs modèles d'épilepsie et campagnes d'écrantage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les modèles d'épilepsie en isolant le stress thermique comme déclencheur défini des crises.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à un contrôle précis de la température et à une surveillance comportementale standardisée.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en identifiant précocement, lors du processus de découverte, les composés ayant des effets ciblés sur la susceptibilité aux crises.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des candidats pour le système nerveux central ajustée au risque, fondée sur leurs effets dans des modèles de crises génétiquement définis.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des souris, l'anesthésie et l'insertion de sondes rectales de température afin de garantir le bien-être animal et l'intégrité des données.
- Dépend de chambres de chauffage étalonnées équipées de contrôleurs numériques de température et de systèmes à air forcé pour un contrôle précis de la rampe thermique.
- Exige des conditions environnementales standardisées (par exemple, litière en copeaux de bois, température ambiante) afin de minimiser la variabilité de la réponse thermique.
- Implique une coordination pluridisciplinaire entre les équipes de comportement, de pharmacologie et de génétique pour une évaluation cohérente des crises et une interprétation uniforme des données.
- Limité aux modèles où la chaleur constitue un facteur déclenchant pertinent des crises ; n'est pas applicable aux mécanismes de l'épilepsie non thermiques sans modification.
