Quantification absolue des pyrophosphates d’inositol par spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire par ionisation électrospray

Cela fournit des résultats de haute qualité pour le métabolisme du phosphate d’inositol dans tous les organismes que nous avons testés jusqu’à présent. Il fournira également un aperçu de la nouvelle voie de biosynthèse cellulaire dont nous sommes actuellement au courant. L’analyse du métabolisme du phosphate d’inositol par CE-ESI-MS est plus rapide, très sensible, et capable de fournir des informations de structure pour les assemblages de phosphate d’inositol.

Pour commencer, mettez en place un système de spectrométrie de masse par électronébulisation par électronébulisation capillaire ou CE-ESI-MS composé d’un système CE commercial et d’un spectromètre de masse en tandem triple quadripolaire, équipé d’une source ESI Agilent Jet Stream. Ensuite, connectez le séparateur de flux de gaine 1:100 et la sortie de la pompe de chromatographie liquide isocratique, et assurez-vous que le flacon d’entrée du système CE est à la même hauteur que l’extrémité du pulvérisateur de l’analyseur de masse. Ensuite, utilisez la version MassHunter Workstation ou un logiciel MS similaire pour contrôler l’ensemble du système et l’acquisition et l’analyse des données.

Après avoir préparé le tampon de fonctionnement CE et le liquide de gaine, installez le liquide de gaine en purgeant à cinq millilitres par minute pendant cinq minutes. Réglez ensuite le débit à un millilitre par minute et la pression de la pompe à 180 bars. Assurez-vous que le tube recyclé se connecte à la bouteille de liquide de la gaine pour réutiliser le solvant.

Ensuite, à l’aide d’un coupe-colonne capillaire avec une lame diamantée rotative, coupez correctement les deux extrémités d’un capillaire CE-MS avec une fenêtre de détection UV. Ensuite, retirez deux à trois centimètres de revêtement de polyimide aux deux extrémités avec un briquet et nettoyez la surface capillaire avec de l’isopropanol. Pour installer le capillaire, faites correspondre le capillaire dans la cassette CE-MS.

Cliquez ensuite sur le bouton Changer de cassette et installez la cassette dans le périphérique CE. Pour activer le capillaire, rincez d’abord le capillaire avec un hydroxyde de sodium molaire, suivi d’eau pendant 10 minutes, puis d’un tampon CE pendant 15 minutes. Ensuite, insérez le capillaire dans le pulvérisateur CE-MS.

À l’aide d’une loupe et de la vis de réglage dans le pulvérisateur, ajustez précisément la sortie capillaire, en veillant à ce que l’extrémité capillaire dépasse d’environ 0,1 millimètre de la pointe du pulvérisateur. Vérifiez la stabilité du pulvérisateur ESI en mode Analyse complète. La fluctuation des électrophérogrammes ioniques totaux devrait être dans les 5%Ensuite, effectuer un essai avec les étalons de phosphate d’inositol.

Après avoir préparé le mélange d’étalons internes, mélanger 10 microlitres de l’échantillon avec 0,5 microlitre du mélange d’étalons internes et un flacon d’échantillon CE. Lorsque vous utilisez le système de réapprovisionnement, cliquez sur le bouton Changer de bouteille. Mettez les 250 millilitres préparés de tampon CE dans la bouteille d’électrolyte.

Cliquez ensuite sur Clean Tubes en gardant l’aiguille de réapprovisionnement dans un flacon d’eau. Définissez les paramètres ESI et MS. Ensuite, optimisez les paramètres de la source à l’aide d’un optimiseur de source avec un mélange de normes de polyphosphate d’inositol et de plusieurs paramètres de surveillance des réactions à l’aide de MassHunter Optimizer avec toutes les normes.

Ensuite, effectuez une exécution pour les extraits de phosphate d’inositol et vérifiez les résultats. Définissez une séquence lorsqu’il y a plus d’échantillons. Après la mesure, laissez le MS en mode veille et n’éteignez pas la pompe de chromatographie liquide.

Remplacez le pulvérisateur CE-ESI-MS par un pulvérisateur LC-ESI-MS lorsqu’il n’y a pas d’alimentation en liquide de gaine. Pour l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse quantitative et créez un lot pour tous les échantillons. Ensuite, créez une nouvelle méthode à partir des données de surveillance de réaction multiple acquises et définissez les phosphates d’inositol de carbone 13 comme étalons internes.

Ensuite, vérifiez le composé de surveillance des réactions multiples, le temps de rétention, les normes internes, la concentration et la configuration du qualificatif. Passez la validation et la sortie pour appliquer la méthode au lot actuel. Enregistrez la méthode.

Vérifiez ensuite si chaque pic du lot est correctement intégré. Sinon, intégrez manuellement le pic. Exportez les résultats dans une feuille de calcul, et quantifiez les pyrophosphates d’inositol, en comparant la réponse de pointe anolyte avec la réponse de crête respective des étalons internes marqués isotopiques stables avec des concentrations connues.

Enfin, avec la concentration mesurée dans le phosphate d’inositol, solution d’extrait et son volume, calculer les quantités absolues et normaliser davantage la quantité par le nombre de cellules ou la teneur en protéines. Calculer la concentration cellulaire en fonction du nombre de cellules et du volume cellulaire moyen des cellules HCT116. Les électrophérogrammes ioniques extraits des étalons pyrophosphate d’inositol à une concentration de deux micromoles sont montrés ici.

Le métabolisme des pyrophosphates d’inositol chez les mammifères avec leurs structures simplifiées est inséré. Une série de cellules HCT116 de l’University College London ou de l’UCL est présentée ici. CE-MS a été utilisé pour quantifier la variation des niveaux IP8 entre les cellules HCT116 de l’UCL et celles des NIH.

Les cellules HCT116 de l’UCL contiennent des niveaux d’IP8 sept fois plus élevés que ceux des NIH. L’accumulation significative de 1 ,5-IP8 dans les cellules HCT116 UCL s’accompagne d’une augmentation considérable de la 1-IP7. L’analyse CE-ESI-MS de cellules HCT116 traitées au fluorure de sodium provenant des NIH a démontré une élévation de 5-IP7, ainsi qu’une réduction de IP6 et une apparition de 5-PPIP4.

Bien que les niveaux de 1-IP7 aient diminué dans une certaine mesure, il n’est pas complètement absent dans les cellules traitées au fluorure de sodium, mais surtout sous la limite de détection. Il est important de former un grade CE-ESI-MS stable. Nous vous recommandons de vérifier la répétabilité et la sensibilité du système avant les mesures.

Cette technique permet de fournir le métabolisme du phosphate d’inositol, implants et tissus, et offre également l’occasion d’étudier de près le pyrophosphate d’inositol biologiquement pertinent.