Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches

L’importance de ce protocole est qu’il fournit un moyen de maintenir fonctionnels les capteurs codés par l’ADN en immobilisant des matrices de plasmides d’ADN dans des microcapsules biocompatibles semi-perméables. La technique d’immobilisation de l’ADN proposée est polyvalente. Il permet la fabrication de biocapteurs multifonctionnels avec différents mécanismes d’activation in vitro.

Nous envisageons que ces microcapsules, associées aux éléments de détection appropriés, pourraient être utilisées pour étudier différents processus biologiques, y compris la libération de molécules de signalisation dans différents environnements tels que les biofilms et les organes. Cette technique peut fournir des informations sur les systèmes biologiques à l’échelle microscopique, en particulier sur la façon dont l’immobilisation de l’ADN et l’encombrement moléculaire peuvent affecter la cinétique et le mécanisme d’activation des gènes. Commencez par le dépôt de la couche primaire de polyéthylèneimine sur les microparticules de silice sacrificielle, ou SiO2, en ajoutant un millilitre de solution de polyéthylèneimine à 300 microlitres de microparticules dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.

Agitez le mélange sur un ThermoMixer à 800 rotations par minute dans des conditions ambiantes. Recueillir les microparticules par centrifugation à 0,2 g pendant une minute à température ambiante et retirer délicatement le surnageant. Après 15 minutes, laver les microparticules quatre fois avec un millilitre d’eau déminéralisée sans DNase ni RNase par centrifugation à 0,2 g pendant une minute à température ambiante, en jetant le surnageant après chaque centrifugation.

Ensuite, ajustez la concentration des plasmides d’ADN de 50 à 200 nanogrammes par microlitre avec de l’eau distillée sans DNase et sans RNase, et utilisez un millilitre des solutions préparées pour déposer l’ADN sur les microparticules amorcées par la polyéthylèneimine. Agitez doucement le mélange de microparticules sur un ThermoMixer à quatre degrés Celsius et 800 tr/min pendant 15 minutes, puis collectez les microparticules par centrifugation à 0,2 g pendant une minute. Marquez les tubes pour les plasmides d’ADN codant pour le riboswitch théophylline, couplé à GFPa1 comme ThyRS-GFPa1, et les plasmides d’ADN codant pour l’aptamère de Brocoli comme BrocApt.

Retirez soigneusement le surnageant et lavez les microparticules quatre fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme démontré précédemment, en jetant le surnageant après chaque centrifugation. Pour déposer la couche de fibroïne de soie, ajoutez un millilitre de la solution aqueuse de fibroïne de soie reconstituée aux microparticules absorbées par l’ADN, et agitez doucement le mélange sur le ThermoMixer à 750 tr/min pendant 15 minutes à 10 degrés Celsius. Collectez les microparticules par centrifugation, puis lavez-les une fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme expliqué précédemment.

Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ajoutez 0,5 millilitre d’eau distillée DNase et RNase, et mélangez les microparticules par vortex. Ensuite, traitez les microparticules avec 0,5 millilitre de méthanol à 100 % à 10 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un ThermoMixer.

Après avoir collecté les microparticules par centrifugation, traitez les particules avec du méthanol à 100 % sur le ThermoMixer à 750 rotations par minute pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius pour la formation d’une feuille bêta. Centrifugez le mélange à 0,2 g pendant une minute à quatre degrés Celsius pour recueillir les microparticules avant de laver les particules deux fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme démontré précédemment. Dissoudre les noyaux de SiO2 des microparticules en ajoutant une solution d’acide fluorhydrique à 8 % aux microparticules de coquille de noyau en granulés.

Transférez les solutions de particules dissoutes dans des appareils de dialyse et dialysez-les contre de l’eau déminéralisée dans un bécher. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, recueillir la suspension de microcapsules de soie des dispositifs de dialyse dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de deux millilitres. Transférez 100 microlitres de l’échantillon de microcapsules dans un seul puits de lames de verre à huit puits et laissez les capsules sédimenter pendant 20 à 30 minutes avant de passer l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, ou CLSM.

Pipette de 100 microlitres de la suspension des capsules dans chaque puits d’une lame de verre chambrée. Dans chaque puits, ajoutez séquentiellement 300 microlitres de solution de fluorophore de poids moléculaires variables du plus bas au plus élevé. Mélangez le mélange en pipetant de haut en bas, et laissez incuber le mélange pendant une heure à température ambiante jusqu’à ce que la diffusion des solutions fluorophores atteigne son équilibre.

Plus tard, transférez la lame sur un CLSM pour imager chaque puits à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 100x à une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres. Identifiez la zone d’intérêt en ajustant le plan focal, et concentrez-vous sur les capsules qui apparaissent sous la forme de cercles du plus grand diamètre. Effectuer une réaction de transcription/traduction in vitro en ajoutant séquentiellement les composants acellulaires à un échantillon de microcapsules et en incubant le tube à 30 degrés Celsius pendant quatre heures.

Vérifiez la fluorescence sur un lecteur de plaques en utilisant la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres et l’émission pour le filtre GFP/FITC à environ 510 nanomètres. Enfin, imagez les microcapsules de soie sur le système CLSM à l’aide de lasers à 488 et 561 nanomètres. Dans l’étude, des microcapuchons robustes en fibroïne de soie d’une taille homogène d’environ 4,5 micromètres et d’une épaisseur de coquille d’environ 500 nanomètres ont été produits.

La perméabilité des enveloppes creuses des capsules de fibroïne de soie a été analysée en suivant la méthode de coupure du poids moléculaire. Une augmentation de la concentration d’une couche primaire de polyéthylèneimine entraîne une augmentation de la stabilité colloïdale des microcapsules avec des coquilles plus perméables, tandis que l’élimination de la couche primaire provoque l’agrégation de capsules avec des membranes de coquille moins perméables. La cinétique d’expression de GFPa1 pendant l’activation de ThyRS a révélé une activation du gène GFPa1 plus élevée à partir de plasmides d’ADN chargés dans des microcapsules de soie que d’ADN témoin non encapsulé.

Dans l’analyse représentative, des images CLSM de capsules de fibroïne de soie chargées de 32 copies d’ADN par capsule avant et après l’incubation dans le système de transcription in vitro et de traduction sont affichées. Les profils d’intensité transversale des capsules de fibroïne de soie ont démontré l’expression de GFPa1. La cinétique de transcription de 20 microcapsules de soie superposées chargées de 30 copies d’ADN par capsule a été comparée à celle de l’ADN témoin non encapsulé.

Le signal de sortie plus élevé des microcapsules de soie que des échantillons d’ADN non encapsulés de concentrations équivalentes a confirmé l’efficacité des microcapsules de soie. En suivant ce protocole, plusieurs techniques de microscopie à haute résolution peuvent être appliquées à l’intrication de l’ADN d’image à l’état immobilisé et au processus d’activation génique découplé in vitro. Cette technique peut être appliquée pour répondre à la dynamique au niveau moléculaire dans des cellules artificielles minimales.

Plus précisément, lorsqu’elles sont associées à des éléments génétiques appropriés, les microcapsules peuvent être utilisées pour étudier la communication de cellule à cellule.