Name: Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Apprenez à préparer des microcapsules de soie biocompatibles chargées de plasmides d'ADN pour des biosenseurs multiplexés in vitro. Cette méthode permet d'étudier les cinétiques d'activation génique.

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Ce travail a été soutenu par la subvention LRIR 16RH3003J du Bureau de la recherche scientifique de l’armée de l’air, ainsi que par le programme Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S & T Priorities (ARAP) du Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour la recherche et l’ingénierie des États-Unis.
La séquence plasmidique vectorielle de ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) a été généreusement fournie par le Dr J. Gallivan. Les cocons de vers à soie de Bombyx mori ont été généreusement donnés par le Dr D.L. Kaplan de l’Université Tufts, MA.

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<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
<li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li>
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<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
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<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
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Les points de vue et opinions présentés ici sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement les points de vue du DoD ou de ses composantes.

Des microcapsules d’hydrogel sélectivement perméables chargées de différents types de conceptions de capteurs codés par l’ADN peuvent être préparées en suivant ce protocole. L’une des caractéristiques distinctives de l’approche LbL est la capacité d’adapter la complexité des microcapsules lors de l’assemblage ascendant, qui commence généralement par l’adsorption d’espèces moléculaires sur des modèles sacrificiels. En ajustant soigneusement les concentrations des composants initiaux, les conditions de pH et le nombre de c...

Le domaine de la biologie synthétique offre des opportunités uniques de développer des capacités de détection en exploitant les mécanismes naturels développés par les micro-organismes pour surveiller leur environnement et les menaces potentielles. Il est important de noter que ces mécanismes de détection sont généralement liés à une réponse qui protège ces micro-organismes contre l’exposition nocive, régulant l’expression des gènes pour atténuer les effets négatifs ou empêcher l’absorption de matières toxiques. Des efforts importants ont été déployés pour concevoir ces microorganismes afin de créer des capteurs de cellules entières tirant parti de ces réponses naturelles, mais en les redirigeant pour reconnaître de nouvelles cibles et/ou produire un signal mesurable pouvant être mesuré à des fins de quantification (généralement la fluorescence)1,2. Actuellement, les préoccupations concernant l’utilisation de micro-organismes génétiquement modifiés (OGM), en particulier lorsqu’ils sont disséminés dans l’environnement ou le corps humain, en raison de fuites de cellules entières ou d’une partie de leur matériel génétique, même encapsulées dans une matrice polymère, suggèrent que d’autres moyens d’exploiter ces approches de détection sont nécessaires3.
Une approche puissante pour exploiter les avantages de la détection basée sur les micro-organismes sans se soucier du déploiement d’OGM est l’utilisation de systèmes de transcription/traduction in vitro (IVTT). D’un point de vue pratique, les systèmes IVTT consistent en un mélange contenant la plupart des composants cellulaires à l’état actif qui a été « extrait » des cellules par différents moyens, y compris la sonication, le battement de perles ou autres4. Le produit final de ce procédé est un mélange réactionnel biochimique déjà optimisé pour effectuer la transcription et la traduction qui peut être utilisé pour tester différents capteurs dans un format « récipient ouvert », sans les contraintes liées à l’utilisation de cellules entières (diffusion membranaire, efficacité de transformation, toxicité cellulaire, etc.). Il est important de noter que différents composants de capteurs peuvent être ajoutés quantitativement et leur effet étudié par différentes techniques optiques et spectrométriques, comme nous l’avons démontré5. Il a été remarqué que les performances des systèmes IVTT peuvent être incohérentes; Cependant, des études récentes ont montré des approches pour standardiser leur préparation et leur caractérisation, ce qui est d’une grande aide lors de l’étude de leurs performances dans la conception de capteurs6. Récemment, de nombreux exemples de systèmes IVTT utilisés pour créer des tests sur papier grâce à la lyophilisation de leurs composants dans des matrices papier ont été démontrés, y compris la détection d’ions de métaux lourds, de médicaments, d’éléments de détection de quorum et autres 7,8,9. Un espace d’application passionnant pour les capteurs basés sur IVTT est leur utilisation dans des applications de détection dans différents types d’environnements, y compris le sol, l’eau et le corps humain. Afin de déployer ces systèmes IVTT dans ces environnements difficiles, une approche d’encapsulation doit être mise en œuvre pour contenir les composants IVTT et les protéger de la dégradation.
Les approches d’encapsulation les plus courantes pour les systèmes IVTT comprennent l’utilisation de capsules lipidiques, de micelles, de polymères et d’autres microconteneurs hermétiquement fermés10,11,12. L’un des inconvénients de cette approche est la nécessité d’incorporer des mécanismes passifs ou actifs pour transporter les matériaux à l’intérieur et à l’extérieur des conteneurs afin de permettre la communication avec l’environnement extérieur et de fournir des capacités de détection. Pour surmonter certains de ces problèmes, l’étude présente une méthode qui fournit une approche simple mais efficace pour encapsuler les matériaux de codage pour différentes conceptions de capteurs à exprimer dans les systèmes IVTT. Cette approche est basée sur l’utilisation du dépôt couche par couche (LbL) d’un biopolymère en présence des plasmides d’intérêt pour créer des microcapsules creuses à porosité élevée, ce qui permet au matériel génétique protégé d’interagir avec les différents composants de l’IVTT de choix. L’étude a démontré que les plasmides encapsulés pouvaient diriger la transcription et la traduction lorsqu’ils étaient activés dans cette matrice polymère, comme le montre la réponse d’un aptamère codé par un plasmide et d’un riboswitch à leurs cibles correspondantes. De plus, ce revêtement LbL protège les plasmides pendant des mois sans conditions de stockage particulières.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidène)-2-méthyl-1-(2,2,2-trifluoroéthyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA Ligase Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Blue Gel Loading Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits, circulaire noire</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent, pour la biologie moléculaire, faible EEO</td></tr><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>en poudre ou en cristaux, BioReagent, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Enzymes de restriction BlpI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td> Corning Systèmes de filtration/stockage sous vide jetables <td></td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de diméthylsulfoxyde de diméthyle, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS, &ge ; 99.9 %</td></tr> <tr><td>Plasmide d’ADN, pET28c-F30-2x Brocoli (5.4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 Kit de marquage d’anticorps (Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Système d’extraction d’E. coli S30 pour ADN circulaire</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes à centrifuger coniques, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques Falcon, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes microcentrifuges, 1,5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Acide fluorhydrique, HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>réactif ACS, 48 %</td></tr> <tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>mélange de kanamycine A (composant principal) et de kanamycine B et C</td></tr><tr><td>Enzymes de restriction KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de gélose LB complétée par 100 & micro ; g/mL d’ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>plaques de gélose pré-coulées avec 100 &micro ; g/mL de gélose d’ampicilline</td></tr><tr><td>LB complétée par 50 & micro ; g/mL de kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>plaques de gélose pré-coulées avec 50 & micro ; g/mL de bouillon LB de kanamycine</td></tr><tr><td>(grade Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de lithium, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>Efficacité maximale DH5-&alpha ; souche E. coli compétente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>anhydre, 99,8</td></tr> %<tr><td>MilliQ-water</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Système de purification d’eau de référence</td></tr><tr><td>MinElute Kit de purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N&prime ;-éthylcarbodiimide, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, ramifiée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>moyenne Mw ~25 000</td></tr><tr><td>PURExpress Kit de Synthèse De Protéines In Vitro</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit d’Extraction de Gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Kit Qiagen</td><td>&nbsp ; 27104</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN Quick-Load 2-Log (0.1-10.0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO® microsphères de silice, 4.0 & micro ; m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24331-15</td><td>Solution aqueuse à 10 %</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 Cassettes de dialyse, 3,5K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de sodium, Na ?CO ?</td><td>Réactif Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS, anhydre, &ge ; 99,5 %, poudre</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dispositifs de dialyse</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre au gel d’ADN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro ; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Théophylline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>anhydre, &ge ; 99 %, poudre</td></tr><tr><td>Tampon Tris Acétate-EDTA (tampon TAE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>Contient 40 mM de Tris-acétate et 1 mM d’EDTA, pH 8,3.</td></tr><tr><td>Pêcheur d’eau distillée sans DNase/RNaseScientific</td><td></td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep</td><td>kit ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’adn codant pour des aptamères d’arn et des riboswitches

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

Nous introduisons un protocole pour la préparation de microcapsules de fibroïne de soie chargées d’ADN via la méthode d’assemblage couche par couche (LbL) sur des noyaux sphériques sacrificiels. Après l’adsorption d’une couche première et de plasmides d’ADN, la formation de microcapsules robustes a été facilitée par l’induction de feuilles de β dans la structure secondaire de la soie lors de la déshydratation aiguë d’une seule couche de soie. Par conséquent, la stratification s’est produite via de multiples liaisons hydrogène et interactions hydrophobes. Lors de l’adsorption de coquilles multicouches, les structures noyau-coquille peuvent être fonctionnalisées davantage avec des nanoparticules d’or (AuNP) et / ou des anticorps (IgG) à utiliser pour la télédétection et / ou la livraison ciblée. L’ajustement de plusieurs paramètres clés lors du dépôt séquentiel de macromolécules clés sur des noyaux de silice, tels que la présence d’un apprêt polymère, la concentration d’ADN et de protéines de soie, ainsi qu’un certain nombre de couches adsorbées, a abouti à des microcapsules biocompatibles chargées d’ADN avec une perméabilité et des charges d’ADN variables. Lors de la dissolution des noyaux de silice, le protocole a démontré la formation de microcapsules creuses et robustes avec des plasmides d’ADN immobilisés sur la surface interne de la membrane de la capsule. La création d’une membrane biocompatible sélectivement perméable entre les plasmides d’ADN et l’environnement externe a préservé l’ADN pendant le stockage à long terme et a joué un rôle important dans l’amélioration de la réponse de sortie des plasmides confinés dans l’espace. L’activité des modèles d’ADN et leur accessibilité ont été testées lors de réactions de transcription et de traduction in vitro (systèmes acellulaires). Les plasmides d’ADN codant pour les aptamères et les riboswitches d’ARN ont été activés avec succès avec les analytes correspondants, comme cela a été visualisé lors de la localisation de transcrits d’ARN marqués par fluorescence ou de la protéine GFPa1 dans les membranes de la coquille.

Ici, l’étude aborde la fonctionnalité des modèles d’ADN codant différents modèles de capteurs (deux types d’éléments de transcription / traduction régulés par l’ARN) après encapsulation dans des capsules de protéines de soie. Les microcapsules ont été préparées au moyen d’un modèle d’assemblage couche par couche (LbL) des composants clés : une couche primaire, des plasmides d’ADN codant pour des conceptions de capteurs et un biopolymère de fibroïne de soie (Figure 2). Le dépôt de macromolécu...

Le protocole décrit la formation de microcapsules chargées d’ADN robustes et biocompatibles sous forme de biocapteurs in vitro multiplexés capables de suivre plusieurs ligands.

Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

L’importance de ce protocole est qu’il fournit un moyen de maintenir fonctionnels les capteurs codés par l’ADN en immobilisant des matrices de plasmides d’ADN dans des microcapsules biocompatibles semi-perméables. La technique d’immobilisation de l’ADN proposée est polyvalente. Il permet la fabrication de biocapteurs multifonctionnels avec différents mécanismes d’activation in vitro.Nous envisageons que ces microcapsules, associées aux éléments de détection appropriés, pourraient être utilisées pour étudier différents processus biologiques, y compris la libération de molécules de signalisation dans différents environnements tels que les biofilms et les organes. Cette technique peut fournir des informations sur les systèmes biologiques à l’échelle microscopique, en particulier sur la façon dont l’immobilisation de l’ADN et l’encombrement moléculaire peuvent affecter la cinétique et le mécanisme d’activation des gènes. Commencez par le dépôt de la couche primaire de polyéthylèneimine sur les microparticules de silice sacrificielle, ou SiO2, en ajoutant un millilitre de solution de polyéthylèneimine à 300 microlitres de microparticules dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres.Agitez le mélange sur un ThermoMixer à 800 rotations par minute dans des conditions ambiantes. Recueillir les microparticules par centrifugation à 0,2 g pendant une minute à température ambiante et retirer délicatement le surnageant. Après 15 minutes, laver les microparticules quatre fois avec un millilitre d’eau déminéralisée sans DNase ni RNase par centrifugation à 0,2 g pendant une minute à température ambiante, en jetant le surnageant après chaque centrifugation.Ensuite, ajustez la concentration des plasmides d’ADN de 50 à 200 nanogrammes par microlitre avec de l’eau distillée sans DNase et sans RNase, et utilisez un millilitre des solutions préparées pour déposer l’ADN sur les microparticules amorcées par la polyéthylèneimine. Agitez doucement le mélange de microparticules sur un ThermoMixer à quatre degrés Celsius et 800 tr/min pendant 15 minutes, puis collectez les microparticules par centrifugation à 0,2 g pendant une minute. Marquez les tubes pour les plasmides d’ADN codant pour le riboswitch théophylline, couplé à GFPa1 comme ThyRS-GFPa1, et les plasmides d’ADN codant pour l’aptamère de Brocoli comme BrocApt.Retirez soigneusement le surnageant et lavez les microparticules quatre fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme démontré précédemment, en jetant le surnageant après chaque centrifugation. Pour déposer la couche de fibroïne de soie, ajoutez un millilitre de la solution aqueuse de fibroïne de soie reconstituée aux microparticules absorbées par l’ADN, et agitez doucement le mélange sur le ThermoMixer à 750 tr/min pendant 15 minutes à 10 degrés Celsius. Collectez les microparticules par centrifugation, puis lavez-les une fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme expliqué précédemment.Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ajoutez 0,5 millilitre d’eau distillée DNase et RNase, et mélangez les microparticules par vortex. Ensuite, traitez les microparticules avec 0,5 millilitre de méthanol à 100 % à 10 degrés Celsius pendant cinq minutes sur un ThermoMixer.Après avoir collecté les microparticules par centrifugation, traitez les particules avec du méthanol à 100 % sur le ThermoMixer à 750 rotations par minute pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius pour la formation d’une feuille bêta. Centrifugez le mélange à 0,2 g pendant une minute à quatre degrés Celsius pour recueillir les microparticules avant de laver les particules deux fois avec un millilitre d’eau distillée sans DNase et sans RNase, comme démontré précédemment. Dissoudre les noyaux de SiO2 des microparticules en ajoutant une solution d’acide fluorhydrique à 8 % aux microparticules de coquille de noyau en granulés.Transférez les solutions de particules dissoutes dans des appareils de dialyse et dialysez-les contre de l’eau déminéralisée dans un bécher. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, recueillir la suspension de microcapsules de soie des dispositifs de dialyse dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de deux millilitres. Transférez 100 microlitres de l’échantillon de microcapsules dans un seul puits de lames de verre à huit puits et laissez les capsules sédimenter pendant 20 à 30 minutes avant de passer l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser, ou CLSM.Pipette de 100 microlitres de la suspension des capsules dans chaque puits d’une lame de verre chambrée. Dans chaque puits, ajoutez séquentiellement 300 microlitres de solution de fluorophore de poids moléculaires variables du plus bas au plus élevé. Mélangez le mélange en pipetant de haut en bas, et laissez incuber le mélange pendant une heure à température ambiante jusqu’à ce que la diffusion des solutions fluorophores atteigne son équilibre.Plus tard, transférez la lame sur un CLSM pour imager chaque puits à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 100x à une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres. Identifiez la zone d’intérêt en ajustant le plan focal, et concentrez-vous sur les capsules qui apparaissent sous la forme de cercles du plus grand diamètre. Effectuer une réaction de transcription/traduction in vitro en ajoutant séquentiellement les composants acellulaires à un échantillon de microcapsules et en incubant le tube à 30 degrés Celsius pendant quatre heures.Vérifiez la fluorescence sur un lecteur de plaques en utilisant la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres et l’émission pour le filtre GFP/FITC à environ 510 nanomètres. Enfin, imagez les microcapsules de soie sur le système CLSM à l’aide de lasers à 488 et 561 nanomètres. Dans l’étude, des microcapuchons robustes en fibroïne de soie d’une taille homogène d’environ 4,5 micromètres et d’une épaisseur de coquille d’environ 500 nanomètres ont été produits.La perméabilité des enveloppes creuses des capsules de fibroïne de soie a été analysée en suivant la méthode de coupure du poids moléculaire. Une augmentation de la concentration d’une couche primaire de polyéthylèneimine entraîne une augmentation de la stabilité colloïdale des microcapsules avec des coquilles plus perméables, tandis que l’élimination de la couche primaire provoque l’agrégation de capsules avec des membranes de coquille moins perméables. La cinétique d’expression de GFPa1 pendant l’activation de ThyRS a révélé une activation du gène GFPa1 plus élevée à partir de plasmides d’ADN chargés dans des microcapsules de soie que d’ADN témoin non encapsulé.Dans l’analyse représentative, des images CLSM de capsules de fibroïne de soie chargées de 32 copies d’ADN par capsule avant et après l’incubation dans le système de transcription in vitro et de traduction sont affichées. Les profils d’intensité transversale des capsules de fibroïne de soie ont démontré l’expression de GFPa1. La cinétique de transcription de 20 microcapsules de soie superposées chargées de 30 copies d’ADN par capsule a été comparée à celle de l’ADN témoin non encapsulé.Le signal de sortie plus élevé des microcapsules de soie que des échantillons d’ADN non encapsulés de concentrations équivalentes a confirmé l’efficacité des microcapsules de soie. En suivant ce protocole, plusieurs techniques de microscopie à haute résolution peuvent être appliquées à l’intrication de l’ADN d’image à l’état immobilisé et au processus d’activation génique découplé in vitro. Cette technique peut être appliquée pour répondre à la dynamique au niveau moléculaire dans des cellules artificielles minimales.Plus précisément, lorsqu’elles sont associées à des éléments génétiques appropriés, les microcapsules peuvent être utilisées pour étudier la communication de cellule à cellule.

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