Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

Ce protocole dissèque les propriétés mécaniques individuelles du noyau cellulaire qui en font une jauge mécanique pour la polarisation, la différenciation et la migration cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer les propriétés mécaniques et d’appliquer des forces aux compartiments subcellulaires sans perturbation externe de la membrane ou du cytosquelette cortical. Le protocole peut être facilement adapté pour manipuler des perles à l’intérieur d’autres cellules d’autres organismes afin d’étudier la mécanique nucléaire dans différentes lignées cellulaires ou modèles animaux.

L’alignement du capteur de force directe est essentiel pour capturer toute la lumière créant et sortant des pièges optiques. Cela garantira des mesures précises du moment lumineux dans le milieu viscoélastique d’une cellule. Commencez la préparation unicellulaire en plaçant les embryons au stade de la sphère quatre heures après la fécondation dans un plat en verre contenant un milieu E3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.

Sélectionnez ensuite les embryons qui sont positifs aux perles et exprimez la protéine fluorescente en cas d’injection d’ARNm. Utilisez des pinces pour déccurionner manuellement les embryons et transférer environ 10 à 15 embryons décurionnés dans un récipient de réaction de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Retirez le milieu E3 du tube et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture tissulaire préchauffé indépendant du dioxyde de carbone.

Secouez doucement le tube en évitant la formation de bulles et assurez-vous que le contenu du tube devient trouble lorsque les cellules se dissocient sans gros morceaux visibles par l’œil. Ensuite, centrifugez le tube à 200 fois G pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et recueillez la pastille pour procéder à la coloration cellulaire.

Pour marquer le noyau, resuspendez les cellules en ajoutant 500 microlitres de la solution de coloration au colorant HOechst ADN fraîchement préparée au tube. Incuber les cellules colorées pendant sept minutes dans l’obscurité. Ensuite, centrifugez les cellules comme décrit précédemment et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de DMEM pour les échantillons en suspension ou 20 microlitres de DMEM pour les cellules en confinement.

Pour la préparation des pièges optiques ou de la chambre OT pour les expériences avec les cellules en suspension, coupez un morceau de scotch double face avec un trou carré d’environ 10 millimètres sur 10 millimètres au centre. Décollez l’une des couches protectrices du ruban adhésif et placez le côté découvert du ruban au centre d’un plat en verre numéro 1,5 H. Appuyez doucement sur le ruban adhésif pour que toute la surface du ruban adhère au verre tout en évitant les bulles d’air et en décollant la couche protectrice restante du ruban.

Incuber la surface avec 100 microlitres de concanavaline A à 0,5 milligramme par millilitre pendant 30 minutes. Retirez ensuite la goutte de Concanavalin A et rincez la surface avec du DMEM. Ajouter 30 microlitres de la solution contenant les cellules sur la surface de la cavité.

Fermez ensuite la chambre très doucement avec un verre de couverture de 22 x 22 millimètres. Utilisez un scalpel ou une pince si nécessaire. Ensuite, procédez au démarrage de la pince à épiler optique en allumant le laser à une puissance considérablement élevée pendant au moins 30 minutes avant l’expérience pour optimiser la stabilité de la puissance de sortie.

Lorsque vous avez terminé, allumez le module électronique des unités de micro-manipulation optique et de mesure de force. Avant d’aligner le capteur de force optique, placez une gouttelette d’eau sur l’objectif d’immersion dans l’eau 60X 1.2 et placez la chambre contenant les cellules sur la scène. Concentrez-vous sur la surface inférieure de la chambre où les échantillons de cellules seront placés.

Après avoir ajouté une gouttelette d’huile d’immersion sur le dessus de la lame de verre de couverture recouvrant l’échantillon, abaissez la lentille de collecte de l’unité de capteur de force jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec la gouttelette d’huile. En suivant la procédure standard pour l’alignement du capteur de force optique, regardez l’image du plan d’échantillonnage sur la caméra auxiliaire à utiliser pour positionner les OT, puis abaissez le capteur de force optique jusqu’à ce que son arrêt de champ apparaisse conjugué sur le plan de l’échantillon. Pour vérifier la présence de bulles d’air avec l’objectif Bertrand, observez le chemin d’imagerie à travers la caméra auxiliaire.

Si des bulles de saleté ou d’air sont visibles, nettoyez la lentille et la chambre avec du tissu de lentille sans poussière avant de répéter la procédure décrite, en ajoutant plus d’huile d’immersion. À l’aide des vis latérales placées sur le support du capteur de force optique, centrez l’arrêt de champ dans le champ de vision. Pour plus de précision, ouvrez l’arrêt de champ presque pour occuper le champ de vision visible sur la caméra auxiliaire.

Après avoir placé l’échantillon dans le microscope et aligné le capteur de force optique, utilisez la plaque demi-onde rotative pour régler la puissance initiale du piège à 200 milliwatts si la rigidité du noyau ou de la structure intercellulaire étudiée n’est pas connue. Une fois cela fait, utilisez le contrôleur logiciel de l’étage du microscope pour rechercher une cellule avec une ou deux perles grâce à la microscopie à fond clair transmise. Dans la feuille numérique, écrivez le déplacement et le temps de chaque étape de trajectoire suivante.

Alternativement, chargez la table S1 à partir du matériau supplémentaire. Pour une expérience de stress/relaxation, programmez les charges trapézoïdales à appliquer. Dans le logiciel OT, activez les pièges optiques.

Pour piéger une microsphère, réglez les plans d’image légèrement au-dessus de la perle avec un contrôleur logiciel de scène de microscope. Cliquez sur la microbille de polystyrène dans la fenêtre d’imagerie de la caméra auxiliaire calibrée. Un confinement réussi de la perle par le piège optique réduira fortement le mouvement de la perle.

Cliquez et faites glisser la perle à travers le cytoplasme et placez-la à une distance d’environ deux microns de l’enveloppe nucléaire. Assurez-vous que la trajectoire est définie de manière à ce que l’indentation de la perle soit perpendiculaire à la membrane nucléaire. Lorsque la configuration est prête, accédez au logiciel d’imagerie et cliquez sur le bouton d’acquisition pour démarrer l’acquisition d’images.

Ouvrez la fenêtre de lecture de force en temps réel, cliquez sur les données et enregistrez dans la fenêtre de lecture de force en temps réel pour enregistrer. Démarrer les données de mesure de la position et de la force du piège. Lancez la trajectoire précédemment chargée en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la perle et en sélectionnant la trajectoire de départ.

Attendez que la trajectoire soit terminée et que le système se stabilise avant de terminer l’enregistrement des données de mesure de la force du piège. Arrêtez l’acquisition d’images et tracez les résultats dans le logiciel de post-traitement. Dans l’analyse représentative, une cellule souche progénitrice isolée du poisson-zèbre avec une seule microsphère proche du noyau est affichée.

La distribution de la microsphère de polystyrène cinq heures après l’injection à l’intérieur d’un embryon a été surveillée. L’image en champ clair et en fluorescence montre que les perles sont dispersées dans le tissu embryonnaire. La projection maximale de la pile Z fluorescente confocale et la projection maximale d’une sous-pile dans la même région confirment qu’une grande fraction de cellules profondes contenait une à deux perles.

24 heures après la fécondation, les perles ont été réparties sur tout le corps de l’embryon. Les micrographies Brightfield des cellules de suspension sur les cellules confinées avec une ou deux billes injectées ont été obtenues. En outre, plusieurs étiquettes fluorescentes ont facilité l’étude de différents aspects des cellules, tels que la membrane internucléaire, la membrane plasmique, l’ADN et la lignée transgénique.

Des instantanés représentatifs ont décrit des noyaux marqués Hoechst cinq secondes avant/pendant et cinq secondes après l’indentation avec une microsphère piégée optiquement. Les profils d’intensité le long du segment d’indentation pour trois cadres et trajectoires différents des limites distales et proximales du noyau au cours d’une expérience d’indentation de cellules en suspension et confinées ont été étudiés. La trajectoire piégée et la force ressentie par la microsphère piégée optiquement au cours d’une expérience répétée d’indentation nucléaire ont été mesurées.

La mécanique du noyau dans les cellules en suspension et en confinement a confirmé que le confinement entraînait une expansion de la zone projetée et un changement insignifiant de la rigidité nucléaire. Si des perles sont injectées dans l’embryon au stade cellulaire, elles se répartiront probablement uniformément dans les stades ultérieurs. Rappelez-vous que la perle doit être piégée de manière stable.

Si la perle s’échappe du piège optique, redéfinissez la trajectoire ou augmentez la puissance du laser. Ces expériences peuvent facilement être effectuées sur plusieurs microbilles à l’intérieur d’une cellule et étendues aux mesures de microrhéologie actives.