Name: Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez la mesure de force directe des propriétés mécaniques nucléaires dans des cellules embryonnaires de zebrafish isolées à l'aide de pinces optiques. Cette méthode permet d'étudier la polarisation et la migration cellulaires sans perturber la membrane.

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MK reconnaît le soutien financier du ministère espagnol de l’Économie et de la Compétitivité à travers le Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), programme Severo Ochoa pour les centres d’excellence en R&D (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), de la Fundació Privada Cellex, de la Fundació Mir-Puig et de la Generalitat de Catalunya par le biais du programme CERCA et Recherche (2017 SGR 1012), en plus du financement par ERC (MechanoSystems) et HFSP (CDA00023/2018). V.R. reconnaît le soutien du ministère espagnol de la Science et de l’Innovation au partenariat EMBL, au Centro de Excelencia Severo Ochoa, au Plan Nacional de MINECO (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) et à la Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. reconnaît le soutien du programme de doctorat ICFOstepstone financé par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie 665884. Nous remercions Arnau Farré pour la lecture critique du manuscrit ; Maria Marsal pour l’aide à l’imagerie et au montage de l’embryon de 24 hpf et; Senda Jiménez-Delgado pour le soutien avec des micronjections de poisson zèbre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode unique pour interroger les propriétés mécaniques du noyau cellulaire à l’intérieur des cellules vivantes. Contrairement à d’autres techniques de spectroscopie de force, le piégeage optique non invasif nous a permis de découpler la contribution de la membrane cellulaire et du cytosquelette de la rigidité nucléaire cellulaire. Il est important de noter que la micromanipulation optique est compatible avec la microscopie multimodale, ce qui permettra à l’expérimentateur d’étudier différents processus impliqués dans la mécanobiologie nucléaire cellulaire. En conséquence, nous avons utilisé la coloration ADN-Hoechst pour mesurer la déformation du noyau lors de l’indentation effectuée par des forces de l’ordre de plusieurs centaines de picoNewton.
Applications potentielles de notre méthode au-delà des exemples décrits dans ce protocole La possibilité d’extraire des informations mécaniques quantitatives à partir de mesures à l’intérieur de cellules vivantes sans perturbations externes permet une pléthore d’opportunités sans précédent qui commencent tout juste à être explorées. Ainsi, le protocole présenté de notre plateforme de micromanipulation optique peut être étendu à des expériences plus complexes avec une grande polyvalence. Les déflecteurs acousto-optiques (AOD) peuvent générer plusieurs pièges optiques pour des mesures de force synchrone à travers différents emplacements de cellules, ainsi que peuvent être utilisés pour la microrhéologie active dans une large gamme de fréquences51,61. Comme cela a été mentionné, la réponse de la force lors de l’indentation peut surmonter la force de piégeage maximale, conduisant à une fuite de la perle du piège optique. Dans ce cas, un retour de force peut être configuré avec l’AOD afin de serrer la force optique. Dans l’ensemble, de multiples approches microrhéologiques, telles que la relaxation du stress décrite dans ce protocole, mais aussi la microrhéologie active ou la conformité au fluage, peuvent être obtenues expérimentalement avec cette plate-forme et analysées en profondeur par de nouveaux progiciels61,62,63,64,65 . En outre, l’application de forces ne se limite pas au noyau mais pourrait en principe être réalisée pour mesurer diverses structures intracellulaires et dans des tissus complexes, comme démontré pour piéger les globules rouges qui circulent à l’intérieur de vaisseaux sanguins intacts66,67 ou piéger et déformer les chloroplastes et les mitochondries68 . L’étalonnage lumière-moment est indépendant de la forme et de la taille de l’objet piégé, ce qui permet des mesures de force directes sur n’importe quelle sonde de force de forme arbitraire38,39. L’utilisation de microsphères injectées nous a permis d’appliquer des forces élevées sur le noyau avec une puissance laser relativement faible par rapport à la manipulation directe des structures cellulaires69,70,71. Cependant, étant donné une différence d’indice de réfraction suffisamment élevée, aucune sonde de force appliquée de l’extérieur n’est nécessaire et les organites intracellulaires peuvent être manipulés directement sans perles injectées (observations non publiées et référence70).
Modifications potentielles de notre méthode pour étendre les applications Différentes tailles de microbilles peuvent être injectées en fonction de l’expérience, mais les contrôles relatifs doivent être effectués. Par exemple, pour étudier les cellules à des stades ultérieurs, de plus petites perles peuvent être injectées. Cela réduira la force maximale qui peut être exercée par le piège optique (comme indiqué dans la référence55). Des perles plus grosses peuvent être injectées pour exercer des forces plus élevées, mais celles-ci peuvent affecter le développement de l’embryon en fonction de leur taille ou de leur stade d’intérêt. Dans les expériences où l’injection de microbilles n’est pas une option, divers organites présentant des différences d’indices de réfraction par rapport à celui du cytoplasme peuvent encore être manipulés optiquement, ce qui donne lieu à des forces optiques mesurables à partir de changements de moment lumineux42. Comme mentionné ci-dessus, ces méthodes ont été utilisées par Bambardekar et al. pour déformer les jonctions cellule-cellule dans l’embryon de drosophile70. De même, le noyau de la cellule a un indice de réfraction inférieur à celui du milieu environnant44, ce qui permet une indentation sans perles (observations non publiées et référence72) même si avec une force de piégeage plus faible. Ainsi, le noyau ne peut pas être piégé facilement et échappe au piège.
L’entretoise PDMS revêtue de spin est fabriquée via une méthode pratique et rapide, mais peut être hors de portée des laboratoires sans accès à une installation de micro/ nanofabrication ou à des laboratoires d’ingénierie. Ainsi, l’entretoise peut être facilement assemblée à partir d’une bande de laboratoire ou d’un parafilm (étape 4). Le protocole peut également être adapté en fabriquant des canaux microfluidiques qui automatisent la livraison de cellules individuelles dans des puits de mesure prédéfinis ou dans une chambre avec une hauteur définie pour estimer l’effet de confinement dans le même échantillon. Cependant, ces dispositifs microfluidiques doivent être conçus de manière à s’adapter à l’espace entre l’objectif du microscope et la lentille collectrice du capteur de force optique, d’environ 2 mm (voir étape 3). Notez que le capteur de force optique doit être positionné à la hauteur appropriée afin qu’aucune aberration optique due à la défocalisation n’affecte la mesure du moment cinétique des photons.
D’autres modifications pourraient inclure le changement de déclarants biologiques. Nous avons constaté que la fluorescence de Hoechst saigne spectralement dans le canal GFP et nous privilégions donc la combinaison avec l’histone marquée mCherry comme marqueur nucléaire pour la mesure simultanée dans deux canaux fluorescents. Alternativement, la déformation nucléaire peut facilement être suivie avec une étiquette ciblée sur la membrane nucléaire interne telle que Lap2b-GFP (Figure 2).
L’indentation sur le noyau cellulaire était de l’ordre de 2-3 microns, que nous pouvions mesurer avec précision par analyse d’image de microscopie confocale à disque rotatif à diffraction limitée. Pour le cas de noyaux plus rigides ou de forces plus petites, l’indentation sera à peine mesurable en utilisant cette approche. Cependant, les pinces optiques étalonnées par force absolue peuvent également être étalonnées pour les mesures de position de la bille piégée in situ à l’aide de l’interférométrie BFP avec une précision nanométrique51. En utilisant cette approche, le signal de tension et le capteur de force optique peuvent être traduits dans la position de la sonde piégée par le paramètre β [nm/ V], tandis que le paramètre invariant α [pN / V] donne des valeurs de force grâce à l’étalonnage lumière-moment susmentionné41 (voir ci-dessous pour plus de détails).
Dépannage Nous avons constaté que les défis suivants pouvaient survenir au cours de l’expérience :
Aucun piège stable ne se forme et la microsphère s’échappe facilement Toute saleté sur l’objectif du microscope ou un collier de correction mal aligné pourrait entraîner la défaillance d’un piège stable. Si aucune solution immédiate n’est trouvée, mesurez la fonction d’étalement ponctuel de la lentille de l’objectif. Si l’échantillon d’intérêt se trouve profondément à l’intérieur d’un tissu optiquement dense, le foyer laser peut subir de graves aberrations optiques conduisant à un piégeage instable (cet effet est généralement négligeable dans les cellules isolées, mais devient plus évident dans les tissus plus épais). Pour une rigidité élevée, la force de restauration du noyau pourrait dépasser la force d’échappement du piège, de sorte que la microsphère est perdue et que la routine d’indentation échoue. Initialement, le bord de la membrane nucléaire proximal au piège optique est à peine indenté (figure S2A). Lorsque cela se produit, le laser de piégeage n’est plus affecté par la force et le mouvement brownien, ce qui entraîne une chute de force à zéro et une diminution du bruit du signal (Figure S2B). Dans le cas où cela se produit, la puissance du laser peut être augmentée pour avoir un piège plus fort, l’amplitude de la trajectoire trapézoïdale poussant la perle dans le noyau peut être réduite, ou la position initiale de la microbille piégée peut être réglée plus loin du noyau.
La cellule se déplace pendant la stimulation Si les cellules ne sont pas suffisamment attachées, le piège à gradient optique déplacera les cellules tout en effectuant la routine d’indentation intracellulaire, de sorte que les forces et la mécanique sous-jacente du noyau soient artéfactuelles. Pour éviter le déplacement de la cellule entière, nous recommandons d’augmenter la concentration de molécules d’adhésion cellulaire à la surface, par exemple, ConA.
Compensation initiale du momentum Si une routine initiale de compensation de momentum n’est pas disponible dans la plate-forme DES OT (étape 6.5), un signal de base artificiel et indépendant de la force doit être corrigé. Ceci est visible sous la forme d’une pente sur la courbe de force même sans perle piégée (figure S1E). Pour effectuer la correction, la même trajectoire doit être effectuée sans perle, à l’extérieur de la cellule exactement à la même position. Pour cela, éloignez la cellule du piège à l’aide du contrôle de scène. À titre de référence, le décalage de force change de 5 pN sur le champ de vision à 200 mW dans notre système; ainsi, il devient négligeable pour les trajectoires courtes. Alternativement, un étage de balayage piézoélectrique peut être utilisé pour déplacer les cellules de l’échantillon, laissant la position du laser constante.
Étapes critiques du protocole présenté Les microsphères doivent être injectées au bon stade, 1 cellule pour assurer une distribution maximale sur l’embryon. Les perles ne doivent pas être fluorescentes afin qu’aucune lumière ne s’échappe dans les canaux fluorescents utilisés pour l’imagerie. Par exemple, même les billes fluorescentes rouges typiques sont clairement visibles dans le canal bleu utilisé pour l’imagerie du noyau cellulaire après la coloration de Hoechst en raison de leur luminosité (excitation: 405 nm; émission: 445 nm). Une fixation stable de la cellule au substrat est essentielle pour éviter le déplacement latéral pendant la routine d’indentation. Si la cellule se déplace pendant la routine, les forces sont sous-estimées. Si cela se produit fréquemment, optimisez le protocole de pièce jointe. Pour les cellules de culture tissulaire, d’autres protéines d’adhésion cellulaire, telles que la fibronectine, le collagène ou la poly-L-lysine, conduisent à un attachement satisfaisant (observations non publiées). Pendant le confinement, les cellules sont soumises à un stress mécanique soudain et sévère. Cela peut causer des dommages aux cellules et souvent l’expérimentateur rencontrera des cellules éclatées si la procédure n’est pas effectuée avec soin. De plus, si la hauteur de confinement est trop petite, toutes les cellules souffriront d’une rupture de l’enveloppe nucléaire ou de dommages irréversibles. Pour les atténuer, abaissez le couvercle supérieur plus lentement et/ou augmentez l’espacement entre le couvercle.
Limites de la technique et suggestions pour les surmonter Une limitation claire de la technique est la pénétration de la lumière laser dans les sections profondes du tissu, ce qui conduit à des aberrations et à un piégeage instable. Ainsi, une limite inférieure de profondeur de pénétration dépend de la clarté de l’échantillon, de la correction d’aberration qui peut être utilisée73 et de la puissance laser appliquée. Il faut tenir compte du fait qu’une puissance laser plus élevée entraîne une excitation thermique de l’échantillon au voisinage de la microsphère. Cependant, le chauffage de l’échantillon provenant du point laser de longueur d’onde de 1064 nm est minimisé pour éviter un stress plausible lié à la chaleur sur nos échantillons biologiques74.
Une autre limite est la force maximale qui peut être mesurée. Même si la détection directe lumière-moment permet des mesures de force bien au-delà du régime de réponse linéaire du piège optique40,41, la force maximale appliquée est de l’ordre de quelques centaines de picoNewtons. Ceci est limité par la puissance du laser et le seuil de dommages consécutifs du matériel biologique mou et les différences d’indice de réfraction, qui ne sont normalement pas supérieures à 0,1 ou 0,344. Plusieurs méthodes ont été proposées pour augmenter la limite de détection de force, par exemple en utilisant la lumière structurée75, les microsphères revêtues d’antireflet76, les particules à indice de réfraction élevé77 ou les points quantiques hautement dopés78.
Les OT peuvent être utilisés pour les mesures de position à l’échelle nanométrique par interférométrie BFP, de sorte que la position de la bille dans le piège est Δx = β Sx, où Sx est le signal de tension du capteur, et β [μm/V] peut être étalonnée à la volée en suivant différents protocoles35,54. Pour un capteur de force optique, il peut être prouvé que le facteur de conversion invariant tension-force α [pN/V] est directement lié à β et à la rigidité du piège, k [pN/μm], à travers α = kβ 37) Dans les expériences avec des déplacements de billes trop petits pour être détectés à partir de l’imagerie optique, cette stratégie peut être utilisée pour compléter les mesures de force avec une détection de petite position. Un exemple est l’application des routines expérimentales présentées ici sur des noyaux très rigides, pour lesquels des forces à des puissances laser raisonnables (200-500 mW) ne sont pas suffisantes pour induire des valeurs d’indentation suffisamment grandes. Dans ce cas, la bille doit être mise en contact avec le noyau et la rigidité de piégeage doit être étalonnée avant la mesure (étape 8.6). L’indentation d du noyau en fonction de la force peut être indirectement déterminée comme suit:
d = xtrap - F/k
où xtrap est la position du piège. Différent du facteur lumière-moment invariant α [pN/V], le facteur β [μm/V] doit être étalonné avant chaque expérience, car il dépend de nombreuses variables locales déterminant la dynamique de piégeage, telles que la taille des particules, la taille du point de piège optique et les indices de réfraction relatifs.

La morphogenèse tissulaire est un processus complexe dans lequel les signaux biochimiques et les forces physiques sont coordonnés spatio-temporellement. Dans l’embryon en développement, des gradients de facteurs de signalisation biochimiques dictent la spécification du devenir et assurent une structure tissulaire correcte1,2. Dans le même temps, les forces intrinsèques et extrinsèques jouent un rôle dans la construction de l’architecture de l’embryon3,4. L’influence de la mécanique du cortex cellulaire dans ce contexte a été largement étudiée5,6. L’interconnexion étroite entre les processus mécanochimiques au cours de la morphogenèse repose sur les propriétés des cellules individuelles pour détecter et répondre aux forces mécaniques dans leur microenvironnement tissulaire. Les cellules décodent ainsi les signaux mécaniques via la présence d’éléments subcellulaires et moléculaires sensibles à la force qui transduisent l’information mécanique dans des voies de signalisation spécifiques contrôlant le comportement cellulaire, le destin cellulaire et la mécanique cellulaire.
Une caractéristique des processus de développement est que les cellules s’organisent en groupes pour construire des structures multicellulaires. En tant que telles, les cellules individuelles se réarrangent rarement et se déplacent seules, mais sont associées à un sociotope serré dans lequel elles montrent un comportement collectif tel que la migration supracellulaire7, les transitions (dé)bloquantes8,9 ou le compactage des blastocystes10. Les forces mécaniques générées à l’intérieur et entre les cellules servent d’indices importants pour instruire la dynamique collective des cellules7,11. Mais même lorsque les cellules se déplacent seules, comme les cellules progénitrices qui se faufilent entre les feuilles de tissus ou les niches tissulaires étroites, elles subissent des forces mécaniques anisotropes étendues lorsqu’elles naviguent dans un environnement tridimensionnel. Ces contraintes mécaniques sur les cellules ont des conséquences profondes sur le comportement cellulaire12,13. Plusieurs mécanismes ont été étudiés qui convergent vers le noyau en tant qu’élément majeur de mécanotransduction14,15, en tant qu’élément mécanique passif ou actif lors de la migration dans un environnement tissulaire 3D dense15,16.
Nous avons récemment proposé un mécanisme qui équipe les cellules pour mesurer les déformations de forme en utilisant le noyau comme mécano-jauge intracellulaire élastique12. Le noyau, étant le plus grand organite d’une cellule, subit de grandes déformations lorsque les cellules se polarisent, migrent ou changent de forme sous un étirement mécanique, un confinement ou un stress osmotique16,17,18,19. Nous avons constaté que l’étirement de l’enveloppe nucléaire avec le positionnement intracellulaire du noyau fournit aux cellules des informations sur l’ampleur et le type de déformation cellulaire (comme la compression cellulaire par rapport au gonflement cellulaire). L’étirement du noyau est associé à un déploiement de la membrane nucléaire interne (INM), qui favorise l’activité lipase cPLA2 (cytosolique phospholipase A2) dépendante du calcium à l’INM, suivie de la libération d’acide arachidonique (AA) et de l’activation rapide de la myosine II au niveau du cortex cellulaire. Cela conduit à une augmentation de la contractilité cellulaire et de la migration des cellules amiboïdes au-dessus d’un seuil de contractilité corticale6. La réponse mécanosensible à la déformation cellulaire se produit en moins d’une minute et est réversible lors de la libération du confinement, ce qui suggère que le noyau agit comme une jauge de contrainte pour la proprioception cellulaire régulant le comportement adaptatif des cellules dans des conditions de stress mécanique. Cette voie mécanosensible s’est avérée active dans les cellules souches progénitrices dérivées d’embryons de poisson-zèbre, à la fois dans les cellules pluripotentes et les cellules engagées dans la lignée12 et est conservée dans différentes espèces et lignées cellulaires20.
En plus des propriétés nucléaires en tant que mécanocapteur cellulaire, l’architecture et la mécanique nucléaires sont intrinsèquement régulées au cours du développement et en réponse à la spécification du devenir cellulaire21, d’où l’ajustement de la mécanosensibilité cellulaire22,23. La conséquence pourrait être un changement dans la conformité nucléaire qui permet des changements morphologiques et des transitions d’un état prémigratoire à un état migratoire et vice versa8.
Plusieurs techniques pour mesurer la mécanique du noyau cellulaire ont été appliquées, telles que la microscopie à force atomique24,25, l’aspiration par micropipette26,27, la technologie microfluidique28 et les micro-aiguilles29. Cependant, beaucoup de ces techniques sont invasives dans le sens où la cellule entière doit être déformée, ce qui limite la mesure des caractéristiques mécaniques et des réponses dépendantes de la force du noyau lui-même. Pour contourner la déformation simultanée de la surface cellulaire et de son cortex cellulaire mécanosensible30, des noyaux isolés ont été étudiés dans divers contextes31,32. Cependant, il n’est pas exclu que l’isolement nucléaire soit associé à une modification des propriétés mécaniques du noyau et de leur régulation (référence24 et observations propres non publiées).
Les pinces optiques (OT) sont une technologie polyvalente qui a permis une pléthore d’expériences en mécanobiologie cellulaire et a joué un rôle déterminant dans notre compréhension de la façon dont les machines moléculaires convertissent l’énergie chimique en énergie mécanique33,34. Les pinces optiques utilisent un faisceau laser étroitement focalisé pour exercer des forces optiques sur les particules diélectriques qui ont un indice de réfraction supérieur à celui du milieu environnant33. De telles forces peuvent être de l’ordre de centaines de pico-Newtons et entraîner un confinement efficace de la particule dans le foyer du piège laser, permettant la manipulation de la particule piégée en trois dimensions. L’utilisation de la lumière présente un avantage important en ce sens que la mesure peut être effectuée de manière non invasive à l’intérieur des cellules vivantes. Les manipulations optiques sont en outre limitées au foyer piège du faisceau laser. Par conséquent, la manipulation peut être effectuée sans stimuler les membranes cellulaires environnantes et ne perturbe pas le cortex actinique ou les processus mécanosensibles au niveau de la membrane plasmique, tels que l’activation dépendante de la force des canaux ioniques.
La difficulté de l’approche par pince optique est de déterminer avec précision les forces appliquées à la microsphère en utilisant des approches classiques qui reposent sur l’étalonnage de force indirecte basé sur le théorème d’équipartition ou l’utilisation de forces de traînée de Stokes définies pour mesurer une force d’échappement dépendante de la puissance laser35. Bien que ces méthodes soient simples à mettre en œuvre dans une expérience in vitro, elles ne peuvent généralement pas être traduites dans un environnement cellulaire. Plusieurs stratégies ont été introduites sur le terrain qui reposent sur un étalonnage direct de la force, dérivé des premiers principes de conservation de la quantité de mouvement36,37. Contrairement à d’autres approches de spectroscopie de force, les mesures de force sont déduites d’un échange local de moment lumineux avec la particule piégée de forme arbitraire38,39. Dans notre installation expérimentale, les changements de quantité de mouvement lumineux résultant des forces optiques sont directement mesurés sans qu’il soit nécessaire d’effectuer un étalonnage in situ des pièges40,41,42,43. Ainsi, les mesures deviennent possibles dans un environnement visqueux tel que l’intérieur de la cellule ou même dans un tissu, et les forces peuvent être facilement quantifiées jusqu’au niveau pN.
Dans ce protocole, nous décrivons un test pour manipuler mécaniquement des organites ou des structures intracellulaires et évaluer quantitativement leurs propriétés mécaniques par une pince optique. Cette configuration est intégrée dans un microscope fluorescent à disque rotatif permettant l’imagerie parallèle du comportement cellulaire ou de la dynamique intracellulaire. Le test permet de caractériser les propriétés mécaniques de compartiments cellulaires spécifiques, tels que le noyau, tout en étudiant simultanément la mécanoréponse possible et l’activation des voies de signalisation moléculaire à la suite de la déformation elle-même. De plus, le piégeage optique des microbilles injectées dans les cellules permet une augmentation de la force d’indentation grâce à un indice de réfraction considérablement plus élevé de la bille de polystyrène (n = 1,59) par rapport au contraste de réfraction intrinsèque44 du noyau (n ~ 1,35) par rapport au cytoplasme (n ~ 1,38). La stratégie présentée peut être facilement adaptée à l’étude d’autres structures intracellulaires et organites, ainsi qu’à d’autres approches impliquant la microrhéologie active, l’utilisation de plusieurs pièges optiques pour sonder simultanément les mêmes structures subcellulaires / différentes, et des mesures ciblant la mécanobiologie cellulaire dans l’embryon vivant.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Lunettes de protection 22 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm Lunettes de protection</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H plats à fond de verre</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>10-um perles</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>1-mm capillaires en verre</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>1-um polystyrène microbilles</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um red-fluorescent billes</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Aqcuisition caméras sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Caméra auxiliaire (Figure 3, AUX)</td><td>Blackfly, FLIR</td><td>BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Double scotch tape</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0.17 mM KCl. 0.33 mM CaCl2. 0.33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Type B : 16484</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de</td> <td>protection IRThorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro chargeur pipette</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromiter</td><td>slide ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 divisions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Platine motorisée</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>Modèle P-97</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme de pince à épiler</td><td>optique Impetux Optics</td><td>Logiciel Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Agent de durcissement</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de post-traitement (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque passe-court (Figure 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à disque rotatif</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moule de micro-injection triangulaire</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Four universel</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’eau</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Au cours du développement d’un organisme multicellulaire, une seule cellule fécondée se divise et donne naissance à de multiples tissus aux fonctions diverses. La morphogenèse tissulaire va de pair avec des changements moléculaires et structurels au niveau de la cellule unique qui entraînent des variations des propriétés mécaniques subcellulaires. En conséquence, même au sein d’une même cellule, différents organites et compartiments résistent différemment aux contraintes mécaniques; et les voies de mécanotransduction peuvent réguler activement leurs propriétés mécaniques. La capacité d’une cellule à s’adapter au microenvironnement de la niche tissulaire est donc en partie due à la capacité de détecter et de répondre aux contraintes mécaniques. Nous avons récemment proposé un nouveau paradigme de mécanosensation dans lequel la déformation et le positionnement nucléaires permettent à une cellule d’évaluer l’environnement physique 3D et confèrent à la cellule un sentiment de proprioception pour décoder les changements de forme cellulaire. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode pour mesurer les forces et les propriétés matérielles qui façonnent le noyau cellulaire à l’intérieur des cellules vivantes, illustrées sur les cellules adhérentes et les cellules confinées mécaniquement. Les mesures peuvent être effectuées de manière non invasive avec des pièges optiques à l’intérieur des cellules, et les forces sont directement accessibles grâce à la détection sans étalonnage de la quantité de mouvement lumineuse. Cela permet de mesurer la mécanique du noyau indépendamment des déformations de la surface cellulaire et de permettre la dissection des voies de mécanotransduction extéroceptives et interoceptives. Il est important de noter que l’expérience de piégeage peut être combinée à la microscopie optique pour étudier la réponse cellulaire et la dynamique subcellulaire à l’aide de l’imagerie par fluorescence du cytosquelette, des ions calcium ou de la morphologie nucléaire. La méthode présentée est simple à appliquer, compatible avec les solutions commerciales pour les mesures de force, et peut facilement être étendue pour étudier la mécanique d’autres compartiments subcellulaires, par exemple les mitochondries, les fibres de stress et les endosomes.

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Ce protocole dissèque les propriétés mécaniques individuelles du noyau cellulaire qui en font une jauge mécanique pour la polarisation, la différenciation et la migration cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer les propriétés mécaniques et d’appliquer des forces aux compartiments subcellulaires sans perturbation externe de la membrane ou du cytosquelette cortical. Le protocole peut être facilement adapté pour manipuler des perles à l’intérieur d’autres cellules d’autres organismes afin d’étudier la mécanique nucléaire dans différentes lignées cellulaires ou modèles animaux.L’alignement du capteur de force directe est essentiel pour capturer toute la lumière créant et sortant des pièges optiques. Cela garantira des mesures précises du moment lumineux dans le milieu viscoélastique d’une cellule. Commencez la préparation unicellulaire en plaçant les embryons au stade de la sphère quatre heures après la fécondation dans un plat en verre contenant un milieu E3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.Sélectionnez ensuite les embryons qui sont positifs aux perles et exprimez la protéine fluorescente en cas d’injection d’ARNm. Utilisez des pinces pour déccurionner manuellement les embryons et transférer environ 10 à 15 embryons décurionnés dans un récipient de réaction de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Retirez le milieu E3 du tube et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture tissulaire préchauffé indépendant du dioxyde de carbone.Secouez doucement le tube en évitant la formation de bulles et assurez-vous que le contenu du tube devient trouble lorsque les cellules se dissocient sans gros morceaux visibles par l’œil. Ensuite, centrifugez le tube à 200 fois G pendant trois minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant et recueillez la pastille pour procéder à la coloration cellulaire.Pour marquer le noyau, resuspendez les cellules en ajoutant 500 microlitres de la solution de coloration au colorant HOechst ADN fraîchement préparée au tube. Incuber les cellules colorées pendant sept minutes dans l’obscurité. Ensuite, centrifugez les cellules comme décrit précédemment et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de DMEM pour les échantillons en suspension ou 20 microlitres de DMEM pour les cellules en confinement.Pour la préparation des pièges optiques ou de la chambre OT pour les expériences avec les cellules en suspension, coupez un morceau de scotch double face avec un trou carré d’environ 10 millimètres sur 10 millimètres au centre. Décollez l’une des couches protectrices du ruban adhésif et placez le côté découvert du ruban au centre d’un plat en verre numéro 1,5 H. Appuyez doucement sur le ruban adhésif pour que toute la surface du ruban adhère au verre tout en évitant les bulles d’air et en décollant la couche protectrice restante du ruban.Incuber la surface avec 100 microlitres de concanavaline A à 0,5 milligramme par millilitre pendant 30 minutes. Retirez ensuite la goutte de Concanavalin A et rincez la surface avec du DMEM. Ajouter 30 microlitres de la solution contenant les cellules sur la surface de la cavité.Fermez ensuite la chambre très doucement avec un verre de couverture de 22 x 22 millimètres. Utilisez un scalpel ou une pince si nécessaire. Ensuite, procédez au démarrage de la pince à épiler optique en allumant le laser à une puissance considérablement élevée pendant au moins 30 minutes avant l’expérience pour optimiser la stabilité de la puissance de sortie.Lorsque vous avez terminé, allumez le module électronique des unités de micro-manipulation optique et de mesure de force. Avant d’aligner le capteur de force optique, placez une gouttelette d’eau sur l’objectif d’immersion dans l’eau 60X 1.2 et placez la chambre contenant les cellules sur la scène. Concentrez-vous sur la surface inférieure de la chambre où les échantillons de cellules seront placés.Après avoir ajouté une gouttelette d’huile d’immersion sur le dessus de la lame de verre de couverture recouvrant l’échantillon, abaissez la lentille de collecte de l’unité de capteur de force jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec la gouttelette d’huile. En suivant la procédure standard pour l’alignement du capteur de force optique, regardez l’image du plan d’échantillonnage sur la caméra auxiliaire à utiliser pour positionner les OT, puis abaissez le capteur de force optique jusqu’à ce que son arrêt de champ apparaisse conjugué sur le plan de l’échantillon. Pour vérifier la présence de bulles d’air avec l’objectif Bertrand, observez le chemin d’imagerie à travers la caméra auxiliaire.Si des bulles de saleté ou d’air sont visibles, nettoyez la lentille et la chambre avec du tissu de lentille sans poussière avant de répéter la procédure décrite, en ajoutant plus d’huile d’immersion. À l’aide des vis latérales placées sur le support du capteur de force optique, centrez l’arrêt de champ dans le champ de vision. Pour plus de précision, ouvrez l’arrêt de champ presque pour occuper le champ de vision visible sur la caméra auxiliaire.Après avoir placé l’échantillon dans le microscope et aligné le capteur de force optique, utilisez la plaque demi-onde rotative pour régler la puissance initiale du piège à 200 milliwatts si la rigidité du noyau ou de la structure intercellulaire étudiée n’est pas connue. Une fois cela fait, utilisez le contrôleur logiciel de l’étage du microscope pour rechercher une cellule avec une ou deux perles grâce à la microscopie à fond clair transmise. Dans la feuille numérique, écrivez le déplacement et le temps de chaque étape de trajectoire suivante.Alternativement, chargez la table S1 à partir du matériau supplémentaire. Pour une expérience de stress/relaxation, programmez les charges trapézoïdales à appliquer. Dans le logiciel OT, activez les pièges optiques.Pour piéger une microsphère, réglez les plans d’image légèrement au-dessus de la perle avec un contrôleur logiciel de scène de microscope. Cliquez sur la microbille de polystyrène dans la fenêtre d’imagerie de la caméra auxiliaire calibrée. Un confinement réussi de la perle par le piège optique réduira fortement le mouvement de la perle.Cliquez et faites glisser la perle à travers le cytoplasme et placez-la à une distance d’environ deux microns de l’enveloppe nucléaire. Assurez-vous que la trajectoire est définie de manière à ce que l’indentation de la perle soit perpendiculaire à la membrane nucléaire. Lorsque la configuration est prête, accédez au logiciel d’imagerie et cliquez sur le bouton d’acquisition pour démarrer l’acquisition d’images.Ouvrez la fenêtre de lecture de force en temps réel, cliquez sur les données et enregistrez dans la fenêtre de lecture de force en temps réel pour enregistrer. Démarrer les données de mesure de la position et de la force du piège. Lancez la trajectoire précédemment chargée en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la perle et en sélectionnant la trajectoire de départ.Attendez que la trajectoire soit terminée et que le système se stabilise avant de terminer l’enregistrement des données de mesure de la force du piège. Arrêtez l’acquisition d’images et tracez les résultats dans le logiciel de post-traitement. Dans l’analyse représentative, une cellule souche progénitrice isolée du poisson-zèbre avec une seule microsphère proche du noyau est affichée.La distribution de la microsphère de polystyrène cinq heures après l’injection à l’intérieur d’un embryon a été surveillée. L’image en champ clair et en fluorescence montre que les perles sont dispersées dans le tissu embryonnaire. La projection maximale de la pile Z fluorescente confocale et la projection maximale d’une sous-pile dans la même région confirment qu’une grande fraction de cellules profondes contenait une à deux perles.24 heures après la fécondation, les perles ont été réparties sur tout le corps de l’embryon. Les micrographies Brightfield des cellules de suspension sur les cellules confinées avec une ou deux billes injectées ont été obtenues. En outre, plusieurs étiquettes fluorescentes ont facilité l’étude de différents aspects des cellules, tels que la membrane internucléaire, la membrane plasmique, l’ADN et la lignée transgénique.Des instantanés représentatifs ont décrit des noyaux marqués Hoechst cinq secondes avant/pendant et cinq secondes après l’indentation avec une microsphère piégée optiquement. Les profils d’intensité le long du segment d’indentation pour trois cadres et trajectoires différents des limites distales et proximales du noyau au cours d’une expérience d’indentation de cellules en suspension et confinées ont été étudiés. La trajectoire piégée et la force ressentie par la microsphère piégée optiquement au cours d’une expérience répétée d’indentation nucléaire ont été mesurées.La mécanique du noyau dans les cellules en suspension et en confinement a confirmé que le confinement entraînait une expansion de la zone projetée et un changement insignifiant de la rigidité nucléaire. Si des perles sont injectées dans l’embryon au stade cellulaire, elles se répartiront probablement uniformément dans les stades ultérieurs. Rappelez-vous que la perle doit être piégée de manière stable.Si la perle s’échappe du piège optique, redéfinissez la trajectoire ou augmentez la puissance du laser. Ces expériences peuvent facilement être effectuées sur plusieurs microbilles à l’intérieur d’une cellule et étendues aux mesures de microrhéologie actives.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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