Name: Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez l'assemblage hybride de novo de génomes bactériens urinaires par séquençage à lectures courtes et longues. Cette méthode génère des génomes circulaires complets pour étudier la résistance antimicrobienne.

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Nous remercions le Dr Moutusee Jubaida Islam et le Dr Luke Joyce pour leurs contributions à ce protocole. Nous tenons également à remercier l’Université du Texas au Dallas Genome Center pour ses commentaires et son soutien. Ce travail a été financé par la Welch Foundation, numéro de prix AT-2030-20200401 à N.J.D., par les National Institutes of Health, numéro de prix R01AI116610 à K.P., et par la chaire Felecia et John Cain en santé des femmes, détenue par P.E.Z.

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<li>Turner, S., Pryer, K. M., Miao, V. P., Palmer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+deep+phylogenetic+relationships+among+cyanobacteria+and+plastids+by+small+subunit+rRNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 46 (4), 327-338 (1999).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole complet d’assemblage du génome hybride décrit ici offre une approche simplifiée pour la culture réussie de divers microbiotes urinaires et uropathogènes, et l’assemblage complet de leurs génomes. Le succès des WGS des génomes bactériens commence par l’isolement de microbes divers et parfois fastidieux afin d’extraire leur ADN génomique. À ce jour, les protocoles de culture d’urine existants n’ont pas la sensibilité nécessaire pour détecter de nombreuses espèces urinaires ou impliquent des approches longues et étendues qui nécessitent un temps et des ressourcesprolongés 11. L’approche de culture d’urine améliorée modifiée décrite offre un protocole simplifié mais complet pour l’isolement réussi des bactéries appartenant à 17 genres urinaires courants, y compris les espèces commensales potentiellement pathogènes ou bénéfiques, et les bactéries aérobies ou anaérobies facultatives et obligatoires. Cela fournit à son tour le matériel de départ nécessaire pour le séquençage et l’assemblage précis des génomes bactériens et pour les expériences phénotypiques critiques, qui contribuent à la compréhension de la santé et de la maladie urinaires. De plus, cette approche de culture modifiée permet un diagnostic clinique plus précis des micro-organismes viables présents dans les échantillons d’urine et permet leur biobanque pour de futures études génomiques. Cependant, ce protocole n’est pas sans limites. Il peut nécessiter de longs temps d’incubation selon l’organisme ainsi que l’utilisation de ressources telles qu’une chambre d’hypoxie ou des incubateurs contrôlés qui peuvent ne pas être facilement disponibles. L’utilisation de GasPaks anaérobies offre une solution alternative, mais ceux-ci sont coûteux et ne produisent pas toujours un environnement durable et contrôlé. Enfin, le biais de culture ainsi que la diversité des échantillons peuvent permettre à des organismes et des uropathogènes particuliers de surpasser les bactéries fastidieuses. Malgré ces limites, une culture de diverses bactéries urinaires est rendue possible par cette approche.
Le séquençage génomique a gagné en popularité avec l’avancement des technologies de séquençage de nouvelle génération qui ont considérablement augmenté à la fois le rendement et la précision des données de séquençage14,15. Couplées au développement d’algorithmes pour le traitement des données et l’assemblage de novo, les séquences complètes du génome sont à portée de main de scientifiques novices et experts15,45. La connaissance de l’organisation globale du génome fournie par les génomes complets offre des informations évolutives et biologiques importantes, y compris la duplication des gènes, la perte de gènes et le transfert horizontal de gènes14. De plus, les gènes importants pour la résistance aux antimicrobiens et la virulence sont souvent localisés sur des éléments mobiles, qui ne sont généralement pas résolus dans les assemblages de génomesprovisoires 15,16.
Le protocole présenté dans le présent document suit une approche hybride pour la combinaison de données de séquençage provenant de plates-formes à lecture courte et à lecture longue afin de générer des assemblages complets du génome. Bien que axée sur les génomes bactériens urinaires, cette procédure peut être adaptée à diverses bactéries provenant de diverses sources d’isolement. Les étapes critiques de cette approche comprennent le suivi d’une technique stérile adéquate et l’utilisation de milieux et de conditions de culture appropriés pour l’isolement des bactéries urinaires pures. En outre, l’extraction d’ADNg intact à haut rendement est essentielle pour générer des données de séquençage exemptes de lectures contaminantes susceptibles d’entraver le succès de l’assemblage. Les protocoles de préparation de bibliothèque ultérieurs sont essentiels pour la génération de lectures de qualité d’une longueur et d’une profondeur suffisantes. Par conséquent, il est extrêmement important de manipuler l’ADNg avec soin lors de la préparation de la bibliothèque pour le séquençage à lecture longue en particulier, car le plus grand avantage de cette technologie est la génération de lectures longues sans limite théorique de longueur supérieure. Des sections sont également décrites pour le contrôle de la qualité (CQ) approprié des lectures de séquençage qui élimine les données bruyantes et améliore les résultats d’assemblage.
Malgré le succès de l’isolement de l’ADN, de la préparation de la bibliothèque et du séquençage, la nature de l’architecture génomique de certaines espèces peut encore constituer un obstacle à la génération d’un assemblage de génome fermé45,46. Les séquences répétitives compliquent souvent le calcul de l’assemblage et malgré de longues données de lecture, ces régions peuvent être résolues avec une faible confiance, voire pas du tout. Les lectures longues doivent donc être en moyenne plus longues que la plus grande région de répétition du génome ou la couverture doit être élevée (>100x)19. Certains génomes peuvent rester incomplets et nécessiter des approches manuelles pour être complétés. Néanmoins, les génomes incomplets assemblés hybrides sont généralement composés de moins de contigs que les génomes brouillons à lecture courte. Il peut être utile d’ajuster les paramètres par défaut de l’algorithme d’assemblage ou de suivre des seuils plus stricts pour le contrôle qualité en lecture. Alternativement, une approche suggérée consiste à mapper les lectures longues aux régions incomplètes à la recherche de preuves du chemin d’assemblage le plus probable, puis à confirmer le chemin en utilisant la PCR et le séquençage de Sanger de la région amplifiée. La cartographie des lectures à l’aide de Minimap2 est suggérée et Bandage offre un outil utile pour la visualisation des lectures cartographiées le long des contigs assemblés fournissant des preuves de la liaison contig47.
Un défi supplémentaire pour générer des génomes complets réside dans la familiarité et le confort avec les outils de ligne de commande. De nombreux outils bioinformatiques sont développés pour offrir des opportunités de calcul à tout utilisateur; cependant, leur utilisation repose sur une compréhension des bases d’UNIX et de la programmation. Ce protocole vise à fournir des instructions suffisamment détaillées pour permettre aux personnes sans expérience préalable de la ligne de commande de générer des assemblages de génomes fermés et de les annoter.

Le microbiome urinaire est un domaine de recherche émergent qui a brisé une idée fausse de plusieurs décennies selon laquelle les voies urinaires sont stériles chez les personnes en bonne santé. Les membres du microbiote urinaire peuvent servir à équilibrer l’environnement urinaire et à prévenir les infections des voies urinaires (IVU)1,2. Les bactéries uropathogènes envahissent les voies urinaires et emploient divers mécanismes de virulence pour déplacer le microbiote résident, coloniser l’urothélium, échapper aux réponses immunitaires et contrer les pressionsenvironnementales 3,4. L’urine est un milieu relativement limité en nutriments caractérisé par une osmolarité élevée, une disponibilité limitée en azote et en glucides, une faible oxygénation et un faible pH5,6,7. L’urine est également considérée comme antimicrobienne, composée de fortes concentrations d’urée inhibitrice et de peptides antimicrobiens tels que la cathélicidine humaine LL-378. L’étude des mécanismes utilisés par les bactéries résidentes et les uropathogènes pour coloniser les voies urinaires est essentielle pour mieux comprendre la santé des voies urinaires et développer de nouvelles stratégies de traitement des infections urinaires. De plus, à mesure que l’échec des thérapies antimicrobiennes de première ligne devient de plus en plus fréquent, il est de plus en plus important de surveiller la dissémination d’éléments génétiques mobiles porteurs de déterminants de la résistance aux antimicrobiens au sein des populations de bactéries urinaires9,10.
Pour étudier les génotypes et les phénotypes des bactéries urinaires, leur culture réussie et le séquençage ultérieur du génome entier (WGS) sont impératifs. Des méthodes dépendantes de la culture sont nécessaires pour détecter et identifier les microbes viables dans les échantillons d’urine11. La culture d’urine clinique standard consiste à plaquer l’urine sur une gélose à 5 % de sang de mouton (BAP) et une gélose MacConkey et à incuber aérobiement à 35 °C pendant 24 h12. Cependant, avec un seuil de détection de ≥105 UFC/mL13, de nombreux membres du microbiote urinaire ne sont pas rapportés par cette méthode. Les techniques de culture améliorées telles que la culture quantitative améliorée de l’urine (EQUC)11 utilisent diverses combinaisons de différents volumes d’urine, temps d’incubation, milieux de culture et conditions atmosphériques pour identifier les microbes couramment omis par la culture d’urine standard. Décrit dans ce protocole est une version modifiée de la CQE, appelée ici protocole de culture d’urine améliorée modifiée, qui permet la culture de diverses bactéries urinaires et uropathogènes en utilisant des milieux sélectifs et des conditions atmosphériques optimales, mais n’est pas intrinsèquement quantitative. L’isolement réussi des bactéries urinaires permet l’extraction de l’ADN génomique (ADNg) pour le WGS en aval et l’assemblage du génome.
Les assemblages de génomes, en particulier les assemblages complets, permettent de découvrir des facteurs génétiques susceptibles de contribuer à la colonisation, au maintien de niches et à la virulence du microbiote résident et des bactéries uropathogènes. Les ébauches d’assemblages de génomes contiennent un nombre diversifié de séquences contiguës (contigs) qui peuvent contenir des erreurs de séquençage et manquer d’informations d’orientation. Dans un assemblage complet du génome, l’orientation et la précision de chaque paire de bases ont été vérifiées14. En outre, l’obtention de séquences complètes du génome permet de mieux comprendre la structure du génome, la diversité génétique et les éléments génétiques mobiles15. Des lectures courtes à elles seules peuvent identifier la présence ou l’absence de gènes importants, mais peuvent ne pas identifier leur contextegénomique 16. Grâce aux technologies de séquençage à lecture longue telles qu’Oxford Nanopore et PacBio, la génération d’assemblages fermés de novo de génomes bactériens ne nécessite plus de méthodes fastidieuses telles que la fermeture manuelle d’assemblages de novo par PCRmultiplex 17,18. La combinaison du séquençage à lecture courte de nouvelle génération et des technologies de séquençage à lecture longue Nanopore permet la génération facile d’assemblages de génomes bactériens précis, complets et fermés à des coûts relativement faibles19. Le séquençage à lecture courte produit des assemblages de génome précis mais fragmentés composés généralement d’une moyenne de 40 à 100 contigs, tandis que le séquençage nanopore génère de longues lectures d’environ 5 à 100 kb de longueur qui sont moins précises mais peuvent servir d’échafaudages pour joindre les contigs et résoudre la synténie génomique. Les approches hybrides utilisant à la fois des technologies à lecture courte et à lecture longue peuvent produire des génomes bactériens précis et complets19.
Décrit ici est un protocole complet pour l’isolement et l’identification des bactéries de l’urine humaine, l’extraction de l’ADN génomique, le séquençage et l’assemblage complet du génome à l’aide d’une approche d’assemblage hybride. Ce protocole met particulièrement l’accent sur les étapes nécessaires pour modifier correctement les lectures générées par le séquençage à lecture courte et longue pour l’assemblage précis d’un chromosome bactérien fermé et d’éléments extrachromosomiques tels que les plasmides.

<table><tbody><tr><td>Équipement :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G29398A</td><td>Centrifugeuse Eppendorf en option mais recommandée</td></tr> -<tr><td></td><td></td><td>-</td><td>N’importe quelle centrifugeuse pour la rotation de cônes et de microtubes à centrifuger (par exemple modèles 5810R/5424R)</td></tr><tr><td>Électrophorèse</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie en gel</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td>Modèles ChemiDoc</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>N’importe quel CO2 (par exemple Thermo Forma modèle 3110)</td></tr><tr><td>Rack magnétique</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>Rack 12 tubes</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>SuivantSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>D’autres modèles Illumina sont acceptables</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>--</td><td>Synergie H1</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2024</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>N’importe quel thermocycleur pour PCR réactions (par exemple système PCR ProFlex)</td></tr><tr><td>Matériaux :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>--</td><td>--</td><td>1M Tris,1M Boric Acid,0.2M EDTA (pH 8.0)</td></tr><tr><td>1429R primer</td><td>Sigma Aldrich (oligos personnalisés)</td><td>--</td><td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kb Ladder</td><td>VWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-Cl (pH 7,5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x Colorant de chargement</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F primer</td><td>Sigma Aldrich (oligos personnalisés)</td><td>--</td><td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad Laboratories</td><td>63001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Système de poche anaérobie - GasPak EZ</td><td>BD Systèmes de diagnostic</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>Cerveau Cœur Infusion Bouillon</td><td>BD Systèmes de diagnostic</td><td>212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC Anaerobe 5 % Sang de mouton Agar</td><td>BD Systèmes de diagnostic</td><td>L007357</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Orientation</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>PA-257481.04</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Tissu</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific K1081</td><td></td></tr><tr><td>Bandes indicatrices anaérobies sèches</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP130210</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’amorçage de cellule d’écoulement</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lavage de cellule d’écoulement</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel Miniprep</td><td>BioBasic</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>Kit de séquençage de ligature</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Research Products International Corp</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Extension de code-barres natif 1-12</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext tampon de ligature rapide</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Module de réparation d’extrémité / dA-tailing module New</td><td>England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA CD Indexes</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Kit de dosage</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de dosage Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 Cellule d’écoulement</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sang de mouton</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DS13250</td><td></td></tr><tr><td>tampon TE</td>-<td>-</td><td>--</td><td>10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Software & Outils bioinformatiques :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandage</td><td>--</td><td>--https://rrwick.github.io/Bandage/</td><td></td></tr> <tr><td>Centre d’épidémiologie génomique</td><td>--</td><td>--</td><td>http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr> <tr><td>CLC Genomics Workbench 12</td><td>QIAGEN</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRcasFinder</td><td>--</td><td></td><td>https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr> <tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante (BUSCO)</td><td>--</td><td>--</td><td>-https://gvolante.riken.jp/</td></tr> <tr><td>Kbase Prokka Wrapper</td><td>--</td><td>-</td><td>-https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td></tr><tr><td>Minimap2</td><td>--</td><td>-- </td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td>NanoFilt--<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>--https://github.com/wdecoster/nanofilt</td><td></td></tr> <tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/wdecoster/nanostat</td></tr><tr><td>PHASTER-</td><td>-</td><td>-</td><td>-https://phaster.ca/</td></tr> <tr><td>Prokka</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST-</td><td>-</td><td>--</td><td>http://quast.sourceforge.net/quast</td></tr><tr><td>Trim Galore</td><td>--</td><td>--https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td><td></td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td>--</td><td>-http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td></tr> <tr><td>Monocycle</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td></tr></tbody></table>

assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Les séquences complètes du génome fournissent des données précieuses pour la compréhension de la diversité génétique et des facteurs de colonisation uniques des microbes urinaires. Ces données peuvent inclure des éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides et les phages extrachromosomiques, qui contribuent à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens et compliquent davantage le traitement des infections des voies urinaires (IVU). En plus de fournir une résolution fine de la structure du génome, les génomes complets et fermés permettent des analyses comparatives et évolutives détaillées. La génération de génomes complets de novo a longtemps été une tâche difficile en raison des limites de la technologie de séquençage disponible. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) à extrémité appariée produit des lectures courtes de haute qualité, ce qui donne souvent des assemblages de génome précis mais fragmentés. Au contraire, le séquençage des nanopores fournit de longues lectures de qualité inférieure conduisant normalement à des assemblages complets sujets aux erreurs. De telles erreurs peuvent entraver les études d’association à l’échelle du génome ou fournir des résultats d’analyse de variantes trompeurs. Par conséquent, les approches hybrides combinant des lectures courtes et longues sont apparues comme des méthodes fiables pour obtenir des génomes bactériens fermés très précis. Il est rapporté ici une méthode complète pour la culture de diverses bactéries urinaires, l’identification des espèces par séquençage du gène de l’ARNr 16S, l’extraction de l’ADN génomique (ADNg) et la génération de lectures courtes et longues par les plateformes NGS et Nanopore, respectivement. En outre, cette méthode décrit un pipeline bioinformatique d’algorithmes de contrôle de la qualité, d’assemblage et de prédiction de gènes pour la génération de séquences complètes annotées du génome. La combinaison d’outils bioinformatiques permet de sélectionner des données de lecture de haute qualité pour l’assemblage du génome hybride et l’analyse en aval. L’approche simplifiée pour l’assemblage hybride du génome de novo décrite dans ce protocole peut être adaptée à l’utilisation dans toute bactérie cultivable.

Ce protocole a été optimisé pour la culture et le séquençage de bactéries urinaires appartenant aux genres énumérés à la figure 1. Toutes les bactéries urinaires ne sont pas cultivables par cette méthode. Les milieux de culture et les conditions sont spécifiés par le genre à la figure 1. Des évaluations exemplaires de l’intégrité de l’ADNg par électrophorèse sur gel sont illustrées à la figure 2. Une vue d’ensemble du pipeline de bioinformatique pour le séquençage du traitement de la lecture, de l’assemblage du génome et de l’annotation est décrite à la figure 3. Un guide pour la structure de répertoire de calcul est fourni à la figure 4 pour simplifier la compréhension du protocole et fournir un cadre pour une organisation réussie. En outre, sont inclus les génomes complets représentatifs de deux Klebsiella spp., K. pneumoniae et K. oxytoca, qui ont été générés par ce protocole. Une représentation de ces assemblages est fournie à la figure 5 et comprend également un exemple incomplet supplémentaire du génome de K. pneumoniae. Un aperçu détaillé de chaque génome complet entièrement annoté est illustré à la figure 6. Enfin, un résumé des statistiques de lecture de séquençage est fourni dans le tableau 1 afin d’offrir une compréhension générale des données brutes et découpées suffisantes pour la génération d’assemblages de génomes fermés de haute qualité. En outre, les paramètres clés des deux représentants complètent Klebsiella spp. les génomes sont répertoriés. Les génomes et les données brutes ont été déposés à Genbank dans le cadre du BioProject PRJNA683049.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> Figure 1: Culture urinaire améliorée modifiée de divers genres urinaires. Tableau de la gélose et du bouillon liquide qui peuvent être utilisés pour cultiver divers genres urinaires. Il est suggéré d’effectuer toute culture à 35 °C comme décrit à la sous-section 1.1. Les cercles représentent des milieux appropriés pour la culture d’un genre particulier, les couleurs ont été choisies arbitrairement pour distinguer un type de média d’un autre. CDC-AN BAP (rouge), CDC Anaerobe Sheep Blood Agar; 5% BAP de mouton (orange), gélose de sang de mouton; BHI (vert), Infusion cœur cérébral; BST (jaune), bouillon de soja tryptique; Orientation CHROMagar (bleu). aGardnerella vaginalis doit être cultivée sur HBT Bilayer G. vaginalis Gélose sélective en atmosphère microaérophile et selon les exigences spéciales de culture de bouillon44. bLes iners de lactobacilles doivent être cultivés sur des plaques de BAP de lapin à 5 % et du bouillon NYCIII dans une atmosphère microaérophile. cLactobacillus spp. peut être cultivé sur MRS dans des conditions microaérophiles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> Figure 2: Imagesde gel d’agarose d’extraction génomique de l’ADN. Images de gel représentatives représentant les résultats de l’extraction de l’ADNg. (A) Voie 1: échelle de 1 kb, Voie 2: ADNg intact représentant une extraction réussie, Voie 3: frottis indiquant un ADNg fragmenté. (B) Voie 1: échelle de 1 kb, voies 2 et 3: contamination par l’ARNr indiquée par deux bandes comprises entre 1,5 kb et 3 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> Figure 3: Flux de travail d’assemblage du génome hybride. Schéma des étapes du contrôle qualité de lecture et du prétraitement à l’annotation d’assemblage. Le découpage de lecture supprime les lectures ambiguës et de mauvaise qualité. Les paramètres Q-score et length sont indiqués et représentent les lectures qui sont conservées. L’assemblage utilise à la fois des lectures courtes et longues pour générer un assemblage hybride de génome de novo. La qualité de l’assemblage est évaluée en fonction de l’exhaustivité et de l’exactitude à l’aide d’outils et de paramètres spécifiés. L’assemblage final du génome est annoté pour tous les gènes et loci spécifiques d’intérêt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> Figure 4: Guide de la structure des répertoires de bioinformatique. Schéma de l’organisation recommandée des répertoires et des fichiers pour le traitement des lectures courtes et longues, l’assemblage hybride, l’annotation du génome et le contrôle qualité. Les principales étapes de traitement des données en ligne de commande sont mises en surbrillance à côté des fichiers et répertoires correspondants. Déclenchement de commandes et d’indicateurs (gras), fichiers d’entrée (bleu), fichiers ou répertoires de sortie (rouge), entrée utilisateur telle que la convention de dénomination de fichier (magenta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> Figure 5: Graphiques d’assemblage du génome par bandage. Graphes représentatifs complets de l’assemblage du génome de (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 et (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25 et assemblage incomplet du génome de (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. Le génome complet de KoPF10 démontre un seul chromosome fermé et le génome complet de KpPF25 se compose d’un chromosome fermé et de cinq plasmides fermés. Le chromosome incomplet de KpPF46 est constitué de deux contigs interconnectés. L’assemblage hybride de novo Unicycler génère un graphique d’assemblage qui est visualisé par Bandage. Le graphique d’assemblage fournit un schéma simpliste du génome, indiquant un chromosome fermé ou des plasmides par un liant reliant deux extrémités d’un même contig. La présence de plus d’un contig interconnecté indique un assemblage incomplet. La taille et la profondeur de Contig peuvent également être notées dans Bandage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> Figure 6: Cartes complètes du génome d’assemblages hybrides annotés. Cartes d’assemblage générées par Geneious Prime pour le génome complet de (A) K. oxytoca KoPF10 et (B) K. pneumoniae KpPF25 montrant des gènes annotés désignés par des flèches colorées le long des épines dorsales plasmidiques. Les chromosomes ne montrent que des gènes d’ARNr et d’ARNt pour plus de simplicité. Les annotations du génome ont été effectuées à l’aide de Prokka comme indiqué à la section 10 de ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> Tableau 1: Caractéristiques représentatives de Klebsiella spp. Paramètres d’assemblage de la souche K. oxytoca KoPF10 et de la souche K. pneumoniae KpPF25. Les numéros d’acquisition pour les données déposées sur ncBI sont fournis. Le nombre de lectures avant et après le rognage est spécifié pour les deux technologies de séquençage. N50 est fourni pour les lectures longues uniquement car les lectures courtes sont d’une longueur contrôlée. Réplication plasmidique prédite à l’aide de la base de données PlasmidFinder v2.1 Enteroebacteriaceae avec des paramètres définis sur 80% d’identité et 60% de longueur. un MLST, type de séquence multilocus. b CDS, séquences de codage. c Réplication plasmidique prédite à l’aide de la base de données PlasmidFinder v2.1 Enterobacteriaceae avec des paramètres définis sur 80% d’identité et 60% de longueur. d Oxford Nanopore Technologies (ONT) a déposé des données de lecture. e Illumina a déposé des données de lecture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Ce protocole détaille une approche globale pour la culture, le séquençage et l’assemblage hybride de novo du génome des bactéries urinaires. Il fournit une procédure reproductible pour la génération de séquences génomiques complètes et circulaires utiles pour étudier les éléments génétiques chromosomiques et extrachromosomiques contribuant à la colonisation urinaire, à la pathogenèse et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens.

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Ce protocole complet enseigne comment générer des génomes proches de diverses bactéries urinaires et permet aux lecteurs sans expérience en codage de mettre en œuvre avec succès des pipelines d’assemblage et d’analyse de génomes basés sur des terminaux. Des assemblages complets de génomes permettent la découverte de gènes contribuant à la colonisation et à la virulence des bactéries commensales et uropathogènes. Les génomes proches donnent un aperçu de l’architecture du génome et des éléments génétiques mobiles.La méthode d’assemblage du génome hybride peut être appliquée à toute bactérie cultivable isolée d’autres sites anatomiques ou niches environnementales pour fournir des informations similaires sur le contenu et l’architecture du génome. Suivez le protocole et le guide du fabricant pour préparer un pool d’ADN double brin et procédez au nettoyage en ajoutant 2,5 fois le volume de perles paramagnétiques au pool d’ADN, puis en agitant doucement le tube pour mélanger le contenu. Faites tourner brièvement l’échantillon à 2 000 fois G et placez l’échantillon sur un rotateur pendant cinq minutes à température ambiante, puis abattez les billes sur l’aimant.Ensuite, lavez la pastille deux fois avec 250 microlitres d’éthanol à 70% fraîchement préparé dans de l’eau sans nucléase sans perturber la pastille. Laissez le tube sur l’aimant pendant les lavages. Aspirer l’éthanol après chaque lavage, puis faire tourner brièvement l’échantillon à 2 000 fois G avant de le renvoyer à l’aimant.Pipette sur l’éthanol résiduel et laisser sécher le granulé pendant 30 secondes. Une fois séché, remettez en suspension la pastille dans 60 à 70 microlitres d’eau sans nucléase et incubez l’échantillon à température ambiante pendant deux minutes, puis abattez l’échantillon sur l’aimant jusqu’à ce que l’élute soit clair. Transférer l’éluat dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre.Quantifier le pool d’ADN double brin concentré à l’aide d’un fluoromètre, puis préparer une aliquote de 700 nanogrammes de l’échantillon dans un volume final de 65 microlitres pour passer à l’étape de ligature de l’adaptateur et conserver le reste du pool à quatre degrés Celsius pour une deuxième série après la fin de la première série. Continuez avec la ligature de l’adaptateur conformément aux instructions du fabricant. Pour procéder au séquençage, mélangez les tampons d’amorçage et amorcez la cellule d’écoulement.Préparez la solution de bibliothèque d’ADN et chargez l’échantillon par goutte sur le port de chargement. Démarrez l’exécution du séquençage. Ouvrez le logiciel d’exploitation pour le séquençage et cliquez sur le bouton démarrer, puis entrez un nom pour l’expérience.Allez pour continuer à la sélection du kit pour sélectionner le kit de préparation de bibliothèque approprié et le pack d’extension de code-barres utilisé, puis cliquez sur Continuer pour exécuter les options. Si vous prévoyez de préparer une bibliothèque suffisante pour une deuxième exécution, ajustez la durée d’exécution de 72 heures par défaut à 48 heures et appuyez sur Continuer jusqu’à basecalling. Cochez l’option basecalling dans config fast basecalling.Définissez le codage à barres sur activé afin que la sortie FASTQ soit coupée des séquences de codes à barres et démultipliée dans des répertoires distincts en fonction du code-barres. Cliquez sur Continuer pour sortir. Ensuite, choisissez où enregistrer les données de séquençage de sortie.Attendez-vous à environ 30 à 50 gigaoctets de données si vous enregistrez uniquement la sortie FASTQ et plus de 500 gigaoctets de données si vous enregistrez la sortie FAST5. Si vous prévoyez de procéder à un filtrage manuel après le séquençage, décochez l’option de filtrage Qscore sept en longueur de lecture non filtrée. Sinon, laissez l’option cochée.Allez pour continuer à exécuter l’onglet de configuration pour passer en revue tous les paramètres. Si les paramètres sont corrects, cliquez sur le bouton Démarrer. Sinon, cliquez sur Retour pour effectuer les ajustements nécessaires.Dans le répertoire des lectures longues, créez de nouveaux répertoires pour chaque code-barres utilisé dans l’exécution. Copiez tous les fichiers fastq qui correspondent à chaque code-barres dans le dossier approprié. Combinez tous les fichiers fastq pour chaque code-barres de chaque exécution.Une fois les fichiers combinés, ouvrez le terminal et accédez aux répertoires de codes-barres dans le répertoire de lectures longues à l’aide de la commande cd. Pour concaténer tous les fichiers fastq par code-barres en un seul fichier fastq, exécutez la commande et répétez la procédure pour chaque code-barres. Utilisez NanoStat pour évaluer la qualité de lecture de l’échantillon en exécutant la commande, puis enregistrez les résultats en copiant la sortie dans un fichier texte ou Word pour référence ultérieure.Une fois les résultats enregistrés, utilisez NanoFilt pour filtrer les lectures MinION, en supprimant les lectures avec Q inférieur à sept et d’une longueur inférieure à 200 en exécutant la commande. Sur le fichier découpé généré, exécutez NanoStat avec la commande. Enregistrez les résultats en copiant la sortie dans un fichier texte ou Word et comparez-les aux résultats précédents pour vous assurer que le filtrage a réussi.Répétez les étapes pour chaque code-barres utilisé dans l’exécution du séquençage. Pour générer un assemblage de génome hybride, organisez les fichiers à lecture courte et les fichiers à lecture longue dans un répertoire unique nommé trimmed_reads. Le répertoire contient donc un fastq précédemment généré.gz pour les lectures longues découpées et deux fastq. gz au format R1 et R2 pour les lectures courtes découpées. Accédez au répertoire trimmed_reads qui stocke les fichiers lus à l’aide de la commande cd dans le terminal.Une fois dans le bon répertoire, compressez les deux fichiers de lecture courte pour les stocker dans le fastq. gz en exécutant la commande. Répétez l’étape pour R1 et R2. Assurez-vous que tous les fichiers lus sont dans le fastq.gz et vérifiez que tous les fichiers correspondent au même isolat. Commencez l’assemblage hybride à l’aide d’Unicycler en exécutant la commande. Une fois l’exécution terminée, passez en revue le monocycleur.pour garantir l’absence d’erreurs. Enregistrez le nombre, la taille et l’état complet ou incomplet du contexte généré. Si des contextes incomplets sont identifiés dans le journal Unicycler, réexécutez Unicycler en mode gras en ajoutant l’indicateur à la commande.Ouvrez Bandage et cliquez sur fichier, puis choisissez le graphique de charge et sélectionnez l’assemblage. gfa qui a été précédemment enregistré dans le unicycler_output_directory généré par Unicycler. Une fois le fichier chargé, cliquez sur le bouton dessiner le graphique dans la barre d’outils de gauche et évaluez si l’assemblage est terminé en examinant comment les contigs sont connectés et organisés.Naviguez dans le terminal jusqu’au dossier qui stocke la sortie Unicycler à l’aide de la commande cd. Exécutez ensuite le protocole quast en exécutant la commande. Passez en revue les rapports générés par quast dans le répertoire de sortie quast_output_directory.Naviguez dans le terminal jusqu’au dossier qui stocke la sortie Unicycler à l’aide de la commande cd, puis exécutez prokka en exécutant la commande. Passez en revue les annotations en ouvrant la table tsv et en téléchargeant le fichier gff généré dans le logiciel d’analyse de séquence. Visualisez et analysez les annotations dans le logiciel.Dans les images de gel représentatives, les résultats de l’extraction de l’ADN génomique ou de l’ADNg sont représentés. Une extraction et une séparation réussies de l’ADNg intact peuvent être observées. Une extraction infructueuse montrant une contamination fragmentée de l’ADNg et de l’ARN est également représentée.Les graphiques d’assemblage du génome des bactéries ont été générés par l’assemblage hybride de novo Unicycler et visualisés par Bandage. Le génome complet de Klebsiella oxytoca KoPF10 a démontré un seul chromosome fermé et le génome complet de Klebsiella pneumoniae KpPF25 était constitué d’un chromosome fermé et de cinq plasmides fermés. Le chromosome incomplet de Klebsiella pneumoniae KpPF46 était constitué de deux contigs interconnectés.Les cartes d’assemblage générées par Geneious Prime pour le génome complet de Klebsiella oxytoca KoPF10 et Klebsiella pneumoniae KpPF25 montrant des gènes annotés désignés par des flèches colorées le long des épines dorsales plasmidiques. Pour garantir la réussite du chargement des cellules de flux, filtrez les lectures longues à l’aide des paramètres recommandés et assurez-vous que tous les fichiers sont dans le fastq. Format gz.Exécutez la commande Unicycler correcte à l’aide de fichiers appartenant au même exemple.

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Genetics

Génétique

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Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue (Vidéo) | JoVE Journal

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

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