Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif

Ce protocole est complémentaire à l’imagerie in vivo. Il permet la quantification du type cellulaire et du niveau cellulaire des radiotraceurs, qui est une échelle différente de celle obtenue in vivo. Le principal avantage de cette technique est sa sensibilité et la résolution cellulaire donnée par l’utilisation de radioligands et le tri cellulaire.

Allumez l’appareil photo et chargez le logiciel d’exploitation. Cliquez sur le bouton home XYZ stage pour effectuer le homing. Configurez l’expérience composée d’une acquisition de numérisation de 10 minutes.

Réglez le mode Pas sur fine et le mode Acquisition sur le mode Liste pour enregistrer l’ensemble du spectre d’émission. Installez le lit et assurez-vous que le système de réchauffement, le capteur respiratoire et l’anesthésie sont fonctionnels et sécurisés. Ensuite, placez un fantôme à l’endroit où la tête de l’animal sera positionnée.

Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs pour les trois dimensions à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran. Assurez-vous que le volume de balayage du fantôme et de l’animal est le même. Démarrez l’analyse fantôme pour un étalonnage ultérieur avec les paramètres précédemment établis.

S’assurer de travailler dans un environnement approprié, autorisé pour les expériences impliquant de la radioactivité. Incuber 100 microgrammes de précurseur de tributyline dans 100 microlitres d’acide acétique avec de l’iodure de sodium et cinq microlitres d’acide paracétique à 37% à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un thermocycleur positionné dans une boîte à gants. Diluer la réaction en utilisant 50% d’acétonitrile dans de l’eau pour atteindre un volume de 500 microlitres.

Injecter les 500 microlitres de la réaction diluée sur une colonne de phase inverse. Isoler le CLINDE avec une CLHP à gradient linéaire allant de 5 à 95 % d’ACN dans de l’acide phosphorique de sept millimolaires pendant 10 minutes. Diluer l’isolat dans l’eau pour atteindre un volume final de 10 millilitres, puis injecter la réaction diluée sur une colonne de concentration.

Éluez le CLINDE de la colonne avec 300 microlitres d’éthanol absolu, puis évaporez l’éthanol en l’incubant dans une centrifugeuse à vide à température ambiante pendant 40 minutes. Diluer le résidu contenant le CLINDE dans 300 microlitres de solution saline pour créer une solution mère. Après avoir mesuré sa radioactivité, diluer la solution mère dans une solution saline pour obtenir une solution de 0,037 mégabecquerel dans 500 microlitres.

Établissez les courbes d’étalonnage avec des composés de référence à froid et résolvez l’équation de régression linéaire :Y égale à AX plus B pour obtenir les coefficients A et B. X représente la masse du composé froid et Y représente l’aire sous les courbes. Vérifiez la zone sous la courbe du radioligand, en mesurant l’absorbance ultraviolette à 450 nanomètres en fonction de la courbe d’étalonnage et de l’aire sous la courbe du radioligand.

Estimer la masse et mesurer l’activité du radioligand. Assurez-vous que l’activité spécifique est supérieure à 1 000 gigabecquerel par micromole. Cliquez sur le bouton Mettre à jour l’image pour mettre à jour la position de l’animal.

Définissez la zone de numérisation en faisant glisser les curseurs à l’aide des trois images dans la partie inférieure de l’écran pour les trois dimensions. Configurez l’expérience sur un scan de 60 minutes constituant 60 images d’une minute. Réutilisez tous les autres paramètres configurés initialement.

Injecter 500 microlitres du radiotraceur radioactif, puis rincer le tube avec 300 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,9%. Simultanément, cliquez sur Démarrer l’acquisition pour lancer l’analyse. Ouvrez le logiciel de reconstruction de l’analyse, puis ouvrez le jeu de données, en recherchant le fichier de paramètres de nom de fichier créé dans le dossier de l’analyse.

Sélectionnez l’isotope qui vous intéresse. Notez que le paramètre de mode liste permet la sélection de plusieurs isotopes à cette étape. Définissez les différents paramètres de reconstruction tels que la taille du voxel, le nombre de sous-ensembles et les itérations comme décrit dans le manuscrit.

Sélectionnez le format de sortie NIFTI, puis sélectionnez Démarrer la reconstruction SPECT. Utilisez une spatule métallique plate et une lame de rasoir pour disséquer les régions d’intérêt du cerveau. Placez les tissus dans un tube centrifuge de deux millilitres et pesez le tissu obtenu.

Mettez les échantillons dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres avec un millilitre de HBSS sans calcium et magnésium, puis centrifugez à 300 fois G pendant deux minutes à température ambiante et retirez le surnageant sans perturber la pastille. Ajouter 1 900 microlitres de mélange d’enzymes un et l’incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en agitant les tubes par inversion toutes les cinq minutes. Ajouter 30 microlitres de mélange d’enzymes deux.

Agiter doucement avec une pipette de 1 000 microlitres d’avant en arrière 30 fois. Ensuite, incuber le mélange pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius tout en agitant les tubes par inversion toutes les cinq minutes. Mélanger doucement d’avant en arrière avec une pipette de 200 microlitres, puis une pipette de 10 microlitres avant d’incuber le mélange pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius pour dissocier les tissus.

Filtrez les cellules avec une passoire cellulaire de 70 micromètres et ajoutez 10 millilitres de HBSS sans calcium et magnésium. Centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Pour l’épuisement de la myéline, remettez en suspension la pastille avec 400 microlitres de tampon d’élimination de la myéline, puis ajoutez 100 microlitres de billes d’élimination de la myéline avant d’incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ajouter cinq millilitres de tampon d’élimination de la myéline et centrifuger 300 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter 500 microlitres de tampon d’élimination de la myéline et placer les pastilles suspendues dans la colonne de champ magnétique. Lavez la colonne avec un millilitre de tampon d’élimination de la myéline quatre fois.

Centrifuger à 300 fois G pendant deux minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Vortex brièvement pour dissocier les cellules et ajouter cinq microlitres de Fc Block CD32. Ajouter 100 microlitres du mélange d’anticorps primaires d’intérêt et incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Centrifuger à 350 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant sans perturber la pastille. Épongez les tubes à l’envers sur du papier souple. Vortex le tube brièvement, puis ajouter 100 microlitres du mélange d’anticorps secondaires et incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ajouter un millilitre de tampon d’élimination de la myéline et répéter la centrifugation. Jetez le surnageant et épongez les tubes à l’envers sur du papier souple. Resuspendez les cellules dans 250 microlitres de PBS stérile et procédez directement au tri cellulaire.

Le scan TEMP in vivo de rats de type sauvage a montré une liaison plus élevée du CLINDE dans le site d’injection de lipopolysaccharide que dans la région contra-latérale du cerveau. Les échantillons ex vivo qui ont subi un tri cellulaire activé par fluorescence des tissus traités par radioligand, ou FACS-RTT, ont révélé la présence d’un plus grand nombre de sites de liaison CLINDE uniquement dans la microglie, montrant que l’origine cellulaire du signal CLINDE dans le côté ipsilatéral du cerveau était la microglie. L’augmentation de la protéine translocatrice, ou liaison TSPO, à 12 mois chez les rats TgF344-AD a été limitée aux astrocytes.

Chez les rats âgés de 24 mois, l’augmentation de la liaison TSPO a été observée en raison d’altérations astrocytaires et microgliales. Chez les rats TgF344-AD plus âgés, les astrocytes striataux présentaient une densité de 5HT2AR diminuée par rapport au type sauvage. Une surexpression corticale de TSPO a été observée dans les astrocytes et les microglies des sujets atteints de MA par rapport aux témoins appariés selon l’âge lorsque FACS-RTT a été effectué sur des échantillons post-mortem de MA humains.

Lorsque vous travaillez avec la radioactivité, suivez les instructions de radioprotection et portez un équipement de protection individuelle approprié. Ensuite, après la procédure, assurez-vous de décontaminer l’environnement de travail. La quantification des protéines et l’analyse de l’expression génique peuvent facilement être effectuées après cette procédure sur des populations cellulaires isolées.