Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique

Ces protocoles sont conçus pour modéliser les effets in vitro de l’utilisation supplémentaire d’oxygène sur le microbiome pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Cette recette de média est conçue pour refléter la composition physiologique des expectorations chez les personnes atteintes de mucoviscidose. Le processus de sparging introduit la capacité de cultiver dans différentes conditions d’oxygène.

Les altérations du milieu des expectorations artificielles lui permettent d’imiter d’autres maladies pulmonaires chroniques et de modéliser des communautés microbiennes dans d’autres conditions, telles que des concentrations de glucose différentes chez les patients atteints concomitants de fibrose kystique et de diabète. Un aperçu des étapes de préparation des milieux d’expectorations artificielles montre le mélange de l’ASCM, de l’ASMM et de l’ASBM préparés. Le tampon de vadrouille est utilisé pour titrer le pH à 6,3 et la stérilisation du filtre du milieu est effectuée dans une chambre froide sur un agitateur orbital.

Pour commencer, préparez un milieu d’expectorations artificielles en ajoutant 250 millilitres d’ASCM à la bouteille d’un litre contenant de l’ASMM. Ajoutez ensuite 250 millilitres d’ASBM à la bouteille moyenne. Titrer le milieu avec un tampon de base à une molaire pour atteindre un pH de 6,3 sur un papier pH.

Réfrigérer les expectorations artificielles à quatre degrés Celsius jusqu’à filtration. Ensuite, pour commencer le processus de filtration, transférez 200 millilitres de milieu d’expectorations artificielles non filtrées à un système de filtration sous vide avec un filtre de taille de pore de 0,22 micromètre. Après avoir connecté le système de filtration à la pompe à vide, allumez la pompe à vide, puis placez la chambre sur un agitateur orbital, en secouant à 90 rotations par minute dans une chambre froide à quatre degrés Celsius.

Changez le filtre après que 350 millilitres de milieu sont filtrés pour surmonter le problème de colmatage. Après une quantité considérable est filtrée, à un milieu supplémentaire de 150 millilitres pour la filtration. Répétez la filtration avec des chambres supplémentaires jusqu’à ce que tous les fluides soient filtrés.

Vue d’ensemble de l’épargnant l’épargne d’oxygène démontrant l’ajout d’expectorations du patient à un milieu d’expectorations artificielles dans un flacon de sérum autoclavé. Ensuite, éparpillez le flacon de sérum scellé avec un mélange de gaz. Enfin, le flacon de sérum est incubé pour obtenir la culture Alec Watts à l’intervalle de 24 heures pour le séquençage ultérieur de la métagénomique.

Pour commencer la culture de flacons de sérum, étiquetez les flacons de sérum autoclavés de 500 millilitres avec les identificateurs d’échantillon, la date et l’heure de l’inoculation et le pourcentage d’oxygène cible. Dans une hotte biologique, ajouter 24 millilitres de milieu d’expectorations artificielles à chaque flacon de sérum mis en place. Pour obtenir un volume d’échantillon suffisant pour chaque condition de culture, si nécessaire, diluer l’échantillon avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile, puis homogénéiser les expectorations avec une aiguille de calibre 18 et ajouter un millilitre des expectorations du patient à chaque flacon de sérum.

Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les bouchons en caoutchouc autoclavés sur le dessus de chaque bouteille de sérum, appuyez sur les bouchons en caoutchouc sans toucher le dessous du bouchon. Après avoir retiré les bouteilles de la hotte, appliquez et sertissez les joints en aluminium. Retirez la pièce maîtresse des joints et essuyez le haut des bouteilles avec une lingette à l’alcool et passez le sceau de la bouteille à travers une flamme de brûleur Bunsen.

Maintenant, fixez une aiguille stérile de calibre 18 à une seringue de liste de piston avec un filtre, insérez d’abord la seringue de libération de gaz apposée dans le flacon. Maintenant, fixez une aiguille stérile de calibre 18 à la sortie de gaz du système et insérez également l’aiguille de sortie de gaz dans la bouteille. Acheminez les jonctions en T des réservoirs à travers le moniteur d’oxygène.

Après avoir vérifié la concentration cible d’oxygène circulant dans le système, ciblez environ cinq litres par minute de débit de gaz. Redirigez les jonctions en T des réservoirs jusqu’à la sortie de gaz. Lorsque le gaz commence à circuler dans le flacon de sérum, portez une attention particulière au manomètre et, si la pression augmente de manière inattendue, éteignez immédiatement le système.

Après avoir couru, l’oxygène s’écoule à travers le flacon de sérum pendant une minute à cinq litres par minute, les réglages permettent 10 échanges d’air et garantissent que l’atmosphère interne atteint la concentration souhaitée de 100% d’oxygène. Retirez le dégagement de gaz, aiguille de calibre 18. Après avoir laissé la pression dans le flacon de sérum s’accumuler dans une atmosphère, retirez immédiatement l’aiguille de sortie de gaz.

Incuber les flacons de sérum dans un agitateur d’incubateur à 37 degrés Celsius à 150 rotations par minute pendant 3, 24 heures d’intervalle. Alec Watts est prélevé à chaque intervalle de 24 heures pour l’analyse en aval et les échantillons sont respargedés à chaque fois. L’exemple ici montre à quoi peut ressembler une culture avant et après l’incubation.

Les niveaux d’oxygène et de pH sortant ont été mesurés au cours du processus de culture pour les échantillons d’expectorations maintenus à 37 degrés Celsius. Avec des intervalles de 12 heures et de 24 heures, les concentrations d’oxygène ont été approximativement maintenues au fil du temps avec une baisse modérée de la concentration en oxygène observée pour les trois conditions. Les niveaux de pH mesurés se situaient dans la plage physiologique sans changements significatifs au fil du temps.

La comparaison de la charge microbienne, de la diversité et de la composition de la communauté entre les expectorations non cultivées et cultivées a révélé une augmentation de 20 fois de la charge microbienne dans les expectorations cultivées. Les mesures de la diversité indiquaient la préservation de la composition de la communauté avec un minimum de différences mondiales introduites par le processus culturel. L’analyse comparative des 120 espèces microbiennes dans les expectorations cultivées et non cultivées a été réalisée par séquençage métagénomique.

46 de ces espèces ont été identifiées dans des échantillons non cultivés et cultivés. Alors que 35 ont été exclusivement identifiés dans des échantillons non cultivés et 39 ont été exclusivement identifiés dans des échantillons cultivés. Des courbes de croissance à base d’absorbants ont été générées pour les agents pathogènes pulmonaires courants de la FK cultivés dans des milieux d’expectorations artificiels à partir d’isolats d’échantillons de patients à une concentration normale d’oxygène de 21 %.

Aucun changement au fil du temps dans la densité optique à 600 nanomètres dans l’ASM seul le contrôle négatif a indiqué une culture sans contamination. Les modèles typiques de courbe de croissance observés indiquent que le milieu ASM peut être utilisé pour la génération de courbes de croissance à l’aide de méthodes optiques. Le séquençage métagénomique est utilisé ici pour décrire la composition de la communauté microbienne.

D’autres techniques telles que le séquençage métatranscriptomique peuvent être utilisées pour évaluer l’expression des gènes ou la métabolomique pour évaluer la production de métabolites.