Name: Quantification des niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Apprenez à quantifier la neurodégénérescence dopaminergique chez Caenorhabditis elegans grâce à un système de notation à sept points. Cette méthode standardisée permet d'évaluer les altérations morphologiques dendritiques avec précision et cohérence.

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Nous tenons à remercier Ian T. Ryde pour sa contribution à l’élaboration de l’échelle de notation et pour son soutien lors de la création de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (T32ES021432 a soutenu KSM, et P42ES010356 à JNM).

1. Préparer les vers pour l’imagerie
NOTE: Voir l’article vidéo JoVEconnexe 31:https://www.jove.com/v/835/
<ol><li>Pour chaque groupe expérimental, pipettez ou choisissez 20 à 30 vers vers une plateforme d’imagerie compatible avec le microscope d’imagerie. La plupart des plates-formes courantes comprennent des tampons de gel d’agarose à 2% montés sur des lames de verre avec un couverclede 31 et des plaques de 96 puits contenant des volumes de puits supérieurs ou inférieurs à 100 μL de milieu liquide.</li>
	<li>Paralyser les vers en ajoutant 30-90 mM d’azide de sodium (NaN3),2,5-8,5 mM de lévamisole HCl, ou un autre agent paralysant aux vers. En cas de paralysie dans un liquide, utilisez une concentration plus élevée d’agent paralysant que si elle paralyse sur des tampons d’agarose. Appuyez doucement sur la plate-forme d’imagerie pour mélanger.</li>
	<li>Laissez les vers paralyser complètement. REMARQUE: Cela peut prendre plusieurs minutes.</li>
</ol>2. Image Neurones dopaminergiques
<ol><li>Localisez les régions de la tête des vers sous fluorescence GFP monocolore à l’aide d’un microscope imageur capable de prendre des piles z.<ol>
<li>Soyez conscient des paramètres d’exposition et d’ouverture; éviter la surexposition des dendrites et maintenir la cohérence des paramètres d’un essai à l’autre. Rendez les dendrites aussi lumineuses que nécessaire pour une visualisation claire; cela entraîne généralement une surexposition du soma. REMARQUE: Les images incluses dans ce protocole ont été capturées à l’aide d’un grossissement de 400x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faites défiler le focus pour trouver les limites supérieure et inférieure où les dendrites sont claires. Définissez-les comme limites supérieure et inférieure pour une capture d’image z-stack.</li>
	<li>Cliquez pour capturer des images z-stack pour chaque ver. REMARQUE: Toutes les étapes suivantes peuvent être effectuées à tout moment.</li>
</ol>3. Préparer des images de neurones dopaminergiques pour la notation
<ol><li>Pour chaque pile z, ouvrez le fichier image à l’aide du logiciel de microscope ou d’un logiciel d’analyse d’image externe, chargez la pile dans le logiciel et compressez la pile en une seule image aplatie.</li>
	<li>Images aveugles entre et au sein des groupes de traitement manuellement ou à l’aide d’un logiciel de mise en aveugle automatique.</li>
</ol>4. Score Dopaminergique Neurones Dendrites
<ol><li>Travaillez avec une image de neurone à la fois. Choisissez l’une des quatre dendrites CEP à évaluer pour les blebs, les ruptures et les irrégularités, y compris les plis, les plis et les courbes. Il est recommandé de marquer de gauche à droite lorsque le nez est en haut de l’image pour assurer la répétabilité du score.</li>
	<li>À l’aide des instructions suivantes, attribuez une valeur de score à la dendrite. Reportez-vous à la figure 1 pour obtenir des exemples d’images de notation représentatives. 0- pas de dégâts, neurones « parfaits » 1- irrégulier (plis, courbes, etc.) 2- <5 blebs 3- 5-10 blebs 4- >10 blebs et/ou bris éliminant <25% de la dendrite totale 5- rupture, 25-75% de dendrite enlevée 6- rupture, >75% de dendrite enlevée<ol>
<li>Si plusieurs critères sont remplis au sein d’une même dendrite (c.-à-d. les plis et les blebs), attribuez le score applicable le plus élevé.</li>
		<li>Ne notez pas les dendrites qui ne sont pas clairement visibles, en raison de problèmes de capture d’image, de chevauchement avec d’autres dendrites, etc. Si vous effectuez un zoom avant sur une image de pile z aplatie, soyez conscient des pixels agrandis ressemblant à de faux blebs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’opération pour chaque dendrite. Répétez l’opération pour toutes les images.</li>
	<li>Enregistrez tous les scores. Les scores peuvent être non aveuglés pour le moment.</li>
</ol>5. Préparer et présenter les données
<ol><li>Calculer le nombre total de dendrites dans chaque groupe de traitement attribué à chaque score de neurodégénérescence. Calculer le nombre total de dendrites notées dans chaque groupe de traitement.</li>
	<li>Divisez le score de neurodégénérescence par le nombre total de dendrites notées dans le groupe de traitement. Présenter les données en proportion de dendrites au sein d’un groupe de traitement à chaque score de neurodégénérescence.</li>
</ol>6. Effectuer une analyse statistique
<ol><li>À l’aide d’un logiciel de programmation ou manuellement, exécutez un test du chi carré pour l’indépendance entre toutes les paires de groupes de traitement à comparer. Le cas échéant, appliquer une correction de Bonferroni de la valeur de p en fonction du nombre de groupes expérimentaux comparés pour tenir compte de plusieurs comparaisons. REMARQUE: Ce test déterminera les différences significatives entre deux groupes, mais les détails du type de différence doivent être nuancés à l’œil.<ol>
<li>Sélectionnez des comparaisons entre groupes expérimentaux. Cela variera en fonction de la conception expérimentale. REMARQUE: Dans nos expériences, généralement, les témoins sont comparés à leurs groupes de traitement respectifs, tous les témoins sont comparés et tous les traitements sont comparés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Pratiquez la notation avec un ensemble d’images de neurones dopaminergiques
<ol><li>Voir le fichier supplémentaire 1 pour un ensemble d’images de neurones présentant toute la gamme de notre système de notation avec commentaire et clé de score. Cet ensemble de pratiques est destiné à former les chercheurs nouveaux à cette méthode et à assurer la fiabilité entre les évaluateurs.</li>
</ol>8. Envisagez d’autres options de protocole
<ol><li>Au lieu de capturer des piles z, complétez la notation au microscope, sans enregistrer ou empiler les images. REMARQUE: Cette option réduit les exigences en matière de capacités technologiques, mais supprime l’option de création d’une archive d’images de neurones aux images aux plus tard, nécessite une mise en aveugle manuelle et autorise la mise en aveugle uniquement entre les groupes de traitement et non à l’intérieur de ceux-ci.</li>
	<li>Au lieu de créer une seule image compressée par pile, terminez la notation en faisant défiler les images de chaque pile z. REMARQUE: Cette option peut être plus facile pour certains marqueurs et elle réduit le risque de voir de faux blebs sur les vers qui se sont déplacés pendant l’imagerie et permet de marquer les dendrites qui se chevauchent, mais nécessite une mise en aveugle manuelle et permet la mise en aveugle uniquement entre et non au sein des groupes de traitement.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Ce protocole montre comment utiliser l’échelle de sept points développée dans notre laboratoire pour quantifier les niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C. elegans. Nous avons créé et partagé cette échelle comme un outil pour normaliser l’analyse du travail de neurodégénérescence dopaminergique chez les vers. Reconnaissant l’importance d’étudier les voies impliquées dans les maladies neurodégénératives très répandues, de nombreux chercheurs profitent de l’adéquation du modèle C. elegans à la visualisation neurobiologique pour étudier la neurodégénérescence29,31,32,33. Cependant, il n’y a pas encore eu d’effort pour réduire la grande variation dans la façon dont les dommages aux neurones sont quantifiés dans la recherche sur la neurodégénérescence chez les vers. Le système de notation présenté ici vise donc à favoriser la cohérence des analyses et à permettre la comparaison entre les études.
Notre système de notation peut être utilisé pour analyser les données dérivées des expériences de C. elegans qui utilisent des rapporteurs fluorescents spécifiques aux cellules qui permettent de visualiser les neurones dopaminergiques - en particulier les dendrites CEP. Plus précisément, les souches marquées au niveau du gène dat-1 pour la visualisation GFP des neurones dopaminergiques sont compatibles avec ce protocole de notation, bien qu’il existe de nombreux autres modèles transgéniques connexes de la MP. Il est possible que ce système de notation soit également utile avec ces modèles; cependant, cela devrait être validé avant de les utiliser. En particulier, il est possible (mais pas testé à notre connaissance) que les souches avec mCherry ne soient pas bien adaptées à ce protocole car l’agrégation mCherry peut être impossible à distinguer des blebs ou conduire à un stress cellulaire. Plutôt que de fournir un commentaire sur tous les modèles spécifiques de LA MP et des troubles neurodégénératifs connexes, nous nous concentrons sur la notation des données de neurodégénérescence elle-même. De plus, ce protocole se concentre uniquement sur la morphologie neuronale et ne prend pas en compte les niveaux de fluorescence du soma. Les tests de neurodégénérescence peuvent être effectués parallèlement à des tests comportementaux pertinents pour les maladies neurodégénératives, telles que la locomotion, la durée de vie et les expériences de santé. Les niveaux de dégénérescence dans les modèles chimiques, génétiques et fondés sur l’âge établis de la MP peuvent également être confirmés et détaillés à l’aide de ce système de notation. Les modèles de mesure, les contributeurs et les voies associées à la MP et à d’autres maladies neurodégénératives peuvent ajouter aux connaissances scientifiques sur ces troubles et indiquer comment gérer la population croissante d’individus touchés. Avoir des résultats de neurodégénérescence comparables dans toute la littérature est essentiel pour soutenir cet objectif.
Pour interpréter les résultats dérivés de ce système de notation, nous proposons de considérer chaque dendrite notée comme n = 1, car différents neurones au sein d’un même ver répondent souvent différemment au traitement. Cela peut être dû au fait que seuls les neurones CEPD sont directement exposés au liquide corporel pseudocoélomique. En tant que tel, cela permet d’afficher la répartition des scores des groupes expérimentaux en proportion du nombre total de dendrites notées dans chaque groupe. Cette méthode, utilisée pour les résultats représentatifs présentés ici, permet une comparaison facile entre les groupes de traitement, tient compte des réponses différentielles au sein du même ver et est facilement analysée avec un test du chi carré complété par une correction de Bonferroni pour plusieurs comparaisons. Un exemple de modèle pour l’enregistrement des scores neuronaux et le calcul des pourcentages se trouve dans le fichier supplémentaire 2. Nous avons envisagé deux méthodes alternatives pour l’analyse des données et identifié les failles dans chacune d’elles. La première option consiste à faire la moyenne des scores des quatre neurones CEP pour chaque ver. Cela paramétre les données; cependant, il suppose une relation linéaire avec l’augmentation du score et perd des informations sur toute variation de la réponse au traitement au sein du même ver. La deuxième option consiste à additionner les scores des quatre neurones CEP pour chaque ver, ce qui paramétre également les données. Cela suppose toujours une relation linéaire entre les scores, mais il tient compte plus habilement des différences au sein de chaque ver que les scores moyens en élargissant les paramètres des scores possibles. Quelle que soit la façon dont les chercheurs décident d’afficher leurs données, les résultats doivent être pris en compte parallèlement à des variables expérimentales telles que l’âge de la souche et du ver; par exemple, les vers plus âgés ont un niveau de dégénérescence de base attendu plus élevé.
Au fur et à mesure que ces résultats du score de neurodégénérescence sont interprétés, les chercheurs doivent également être conscients de quelques mises en garde et limites de la méthode de notation. Tout d’abord, certaines exigences technologiques sont nécessaires pour capturer des images adaptées à la notation. Le microscope imageur doit prendre en charge les canaux de fluorescence et les paramètres de grossissement et d’exposition qui permettent une visualisation claire des dendrites CEP. Comme indiqué dans le protocole, les exigences technologiques peuvent être réduites par des ajustements de protocole tels que la notation d’images en direct à travers le champ microscopique plutôt que de capturer des images à archiver et à noter ultérieurement. Deuxièmement, les méthodes d’analyse statistique possibles pour ces données sont limitées car les données ne sont pas paramétriques. L’échelle de notation est présumée progressive, mais ne peut pas être considérée comme numérique car il existe des options de score discrètes et les augmentations de score ne sont pas nécessairement proportionnelles les unes aux autres en ce qui concerne la fonction biologique. Pour ces raisons, les tests d’indépendance du chi carré conviennent mieux à ce type de données, ce qui signifie que l’analyse statistique dépend de l’observateur pour déterminer la direction de toute signification statistique. Notamment, le test du chi carré n’analyse également que les différences dans la distribution des scores et n’est pas en mesure de fournir des preuves de différences dans des catégories de notation spécifiques. Enfin, la signification fonctionnelle des changements morphologiques quantifiés par ce système de notation n’a pas encore été étudiée.
Les orientations futures suscitées par le développement de ce système de notation impliquent la détermination des bases biologiques et des corrélations avec les scores individuels des neurones. L’étude de la signification fonctionnelle (par exemple, la signalisation neuronale, le comportement des vers) de tous les points de l’échelle de notation permettra de mieux traduire les résultats en conclusions applicables à la compréhension des causes et des conséquences des maladies neurodégénératives et au développement d’options de prévention et de traitement. Les recherches futures sur la neurodégénérescence chez les vers devraient viser à découvrir des liens avec d’autres morphologies, telles que la forme et la taille des vers. De plus, la recherche sur la neurodégénérescence peut être soutenue par l’étude d’autres souches de C. elegans pour mesurer des paramètres tels que la bioénergétique, la production d’espèces réactives de l’oxygène et la morphologie mitochondriale.

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative de plus en plus courante qui touche jusqu’à 10 millions de personnes dans le monde1. Les hommes et les personnes âgées sont plus à risque de développer la MP; l’âge moyen d’apparition de la maladie est de 60 ans, et l’incidence de la MP grimpe d’une incidence de 0,3 % dans la population générale à 3 % chez les personnes de plus de 80 ansde 1à2ans. Bien que les détails de la pathologie de la MP ne soient pas entièrement compris, ce trouble progressif implique la perte de neurones dopaminergiques dans la région de la substantia nigra du mésencépharisme. Les mécanismes hypothétiques de cette perte neuronale impliquent un dysfonctionnement mitochondrial, un stress oxydatif et une inflammation2. Les causes et les facteurs de risque de la maladie sont encore à l’étude, mais impliquent une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques1. Par exemple, des études ont trouvé des associations positives entre l’utilisation de pesticides tout au long de la vie et la MP, ainsi qu’une susceptibilité génétique à lafamiliale 1,3.
Le système modèle C. elegans, développé à l’origine en partie pour la recherche en neurobiologie4,est bien adapté à l’évaluation de la perte de neurones dopaminergiques in vivo. Nass et ses collègues ont été les pionniers de l’utilisation de C. elegans pour la neurodégénérescence dopaminergique5, et de nombreux groupes ont depuis adopté le ver comme modèle réussi pour la MP et le dysfonctionnement dopaminergique6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans sont de bons modèles de maladies neurodégénératives pour bon nombre des mêmes raisons qu’ils sont un organisme modèle si populaire pour d’autres domaines de la biologie; leur transparence permet l’étude in vivo des processus cellulaires, la manipulation génétique chez les vers est relativement rapide et facile, ils ont un temps de génération court d’environ trois jours, et ils sont faciles à maintenir21. La plupart des modèles de vers appartiennent à l’une des trois catégories suivantes : les modèles basés sur l’âge, les modèles chimiques et les modèles génétiques. La capacité de synchroniser une population de vers permet d’étudier la neurodégénérescence liée à l’âge pour un modèle basé sur l’âge de maladies neurodégénératives associées au vieillissement, telles que22. Des expositions chimiques induisant des anomalies neuronales de type ont été établies à l’aide d’une variété de produits chimiques, notamment la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), la roténone et le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP)22. Les vers sont également utilisés avec succès comme modèles génétiques de la MP; les souches avec des knockouts de gènes neuronaux sélectionnés peuvent modéliser diverses maladies neurodégénératives1,4. Les combinaisons de facteurs génétiques et environnementaux, ou « interactions gène-environnement », qui jouent probablement un rôle majeur dans2,17,23,24,25,26,27,28, ont été examinées par plusieurs groupes utilisant C. elegans. Enfin, une neurodégénérescence dopaminergique liée à l’âge a également été observée29,30. Si vous utilisez une souche transgénique neurale appropriée en imagerie fluorescente, l’un de ces modèles de vers peut être utilisé pour étudier la neurodégénérescence dopaminergique.
La quantification des changements dans la morphologie neuronale est un élément essentiel de la recherche neurodégénérative. Chez C. elegans,de nombreuses souches de rapporteurs fluorescents ont été utilisées pour visualiser les changements morphologiques et la perte de neurones. Les souches adaptées à l’imagerie neuronale présentent une protéine fluorescente associée à des promoteurs spécifiques aux cellules. Pour les tests de neurodégénérescence dopaminergique, notre laboratoire a utilisé la souche BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], qui a une étiquette de protéine fluorescente verte (GFP) dans le gène dat-1, exprimée dans les neurones dopaminergiques. Notez que le phénotype à rouleaux du BY200 a une très faible pénétrance et est rarement observé. D’autres souches courantes utilisées pour ce type d’imagerie comprennent BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], et plusieurs autres disponibles auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou sur demande auprès de laboratoires spécifiques1,21,22,29 . Ces souches permettent généralement de visualiser les trois classes de neurones dopaminergiques : les neurones céphaliques (CEP), les neurones deirides antérieurs (ADE) et les neurones postdéirides (PDE). C. elegans n’exprime pas naturellement la protéine alpha synucléine, mais des souches telles que BY273 ont été conçues pour l’exprimer. Cependant, nous notons que le système de notation que nous présentons a été développé en utilisant BY200, qui n’exprime pas l’alpha synucléine, et devrait être validé avec cette souche (ou toute autre nouvelle souche) avant utilisation. Des neurones dopaminergiques supplémentaires sont présents chez les hommes, mais sont rarement pris en compte car les hommes représentent normalement <1% d’une population de C. elegans. Ici, nous nous concentrons sur les quatre neurones dopaminergiques CEP trouvés dans la région de la tête de C. elegans. Cet ensemble de neurones est facilement localisé sous microscopie fluorescente, est présent dans les vers hermaphrodites et mâles, ne se chevauche généralement pas avec d’autres zones d’autofluorescence et est couramment rapporté dans les études sur les vers. Notamment, bien que ces neurones ne soient pas myélinés, les neurones dorsaux du CEP (CEPD) sont directement exposés au liquide corporel pseudo-célomique où les neurones ventraux du CEP ne le sont pas. Un ensemble sain de dendrites CEP s’affiche généralement sous forme de lignes relativement droites et ininterrompues. Les dendrites dégénérées peuvent présenter n’importe quelle combinaison d’irrégularités et de signes de dommages, y compris des points prononcés appelés blebs le long de la ligne de la dendrite et des ruptures dans la ligne de la dendrite. Des exemples de neurones CEP à différents niveaux de dégénérescence peuvent être vus dans la figure 1.
Bien que la neurodégénérescence dopaminergique soit étudiée par un nombre croissant de laboratoires de C. elegans, il y a eu une grande variation dans les méthodes analytiques de quantification des dommages aux neurones dopaminergiques29,31,32,33,34. De nombreuses études publiées ont rapporté la présence ou l’absence de soma CEP avec un système de notation binaire de neurones dégénératifs par rapport à des neurones de type typique ou sauvage31,32. Ces méthodes de notation peuvent identifier certains facteurs de stress qui induisent la neurodégénérescence, mais ne peuvent pas quantifier les détails de la progression de dommages neuronaux plus subtils, ni détecter facilement les différences entre la neurodégénérescence induite par des produits chimiques uniques ou d’autres variables. De plus, les systèmes de notation axés sur les corps cellulaires peuvent ne pas être sensibles à des niveaux moins graves de dommages ou à des dommages neuronaux affectant seulement une partie de la cellule, comme la dendrite. Étant donné que la dendrite semble avoir la plus grande gamme de changements morphologiques constamment détectables en réponse aux facteurs de stress chimiques, nous les avons sélectionnés comme base de notre analyse. Le système de notation que nous présentons ici est modifié à partir d’échelles multi-points basées sur la morphologie des dendrites qui ont déjà été utilisées dans notre laboratoire29,33. Ce système élargit ces échelles de cinq et six points en une échelle de sept points pour tenir compte des changements morphologiques liés à l’âge, tels que le nombre plus élevé attendu de plis chez les dendrites des personnes âgées, et pour différencier les dommages graves et la perte complète de dendrite. Le but de l’introduction de ce système de notation est de fournir la capacité de capturer une image complète de la neurodégénérescence à tous les niveaux de dommages neuronaux et de fournir un système universel pour soutenir la cohérence dans la recherche sur la neurodégénérescence dopaminergique de C. elegan. Parce que la notation est intrinsèquement subjective, il est essentiel de maximiser la cohérence entre les individus qui marquent et d’aveugler le marqueur à l’identité des images en utilisant l’aveuglement manuel ou un programme d’aveuglement automatique35. Pour améliorer la cohérence, nous présentons une série d’images de formation et utilisons les capacités vidéo de JoVE pour démontrer notre système de notation en détail. Nous vous recommandons d’utiliser un système qui permet à la fois une notation automatisée en aveugle et permet au marqueur de quantifier sa cohérence de notation en re-marquant un sous-ensemble d’images. Ceci est particulièrement important lors de la combinaison ou de la comparaison de données de plusieurs scientifiques, ou de la formation de scientifiques nouveaux à la notation.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td>Pour l’imagerie dans les puits</td></tr><tr><td>Blinder</td><td>Solibyte Solutions LLC</td><td></td><td>Logiciel gratuit qui aveugle entre et dans les ensembles téléchargés de fichiers d’image</td></tr><tr><td>BY200 [vtIs1 (dat-1p ::GFP, rol-6)]</td><td>Aschner Lab</td><td></td><td>C. elegans souche adaptée à l’imagerie fluorescente des neurones dopaminergiques. Peut être remplacé par d’autres souches avec un rapporteur fluorescent piloté par des promoteurs spécifiques à la cellule Disponible sur demande auprès du laboratoire Meyer</td></tr><tr>Milieu<td>K</td><td></td><td></td> complet <td>51 mM chlorure de sodium, 32 mM chlorure de potassium, 3 mM chlorure de calcium, 3 mM sulfate de magnésium, 13 mM</td></tr><tr><td>cholestérol Lamelles 22x22mm, verre n°</td>1 <td>VWR VistaVision</td><td>48366-067</td><td>Pour l’imagerie sur lames de</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Solvant Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>pour l’exposition à la roténone</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.5e ou plus récent. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, États-Unis, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td><td>Sotware pour la manipulation d’images</td></tr><tr><td>Keyence BZ-X Microscope à fluorescence tout-en-un</td><td>Keyence</td><td></td><td>Utilisé pour la capture d’images de neurones dopaminergiques fluorescents. Peut être remplacé par d’autres microscopes pouvant être étudiés pour l’imagerie fluorescente à haute résolution</td></tr><tr><td>Lames de microscope 3x1"</td><td>VWR VistaVision</td><td>16004-420</td><td>Pour l’imagerie sur lames</td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Inhibiteur de la chaîne de transport d’électrons I</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN_3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td> paralytique <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>Pour la lyse à l’eau de Javel</td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td>VWR</td><td>RC7495.5-32</td><td>Pour la lyse à l’eau de Javel</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétramisole (Lévamisole) (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td>Paralytique</td></tr></tbody></table>

quantification des niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez caenorhabditis elegans

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

La perte de neurones dopaminergiques est impliquée dans la pathologie de la maladie de Parkinson (MP), une maladie neurodégénérative très répandue affectant plus de 10 millions de personnes dans le monde. Étant donné que de nombreux détails sur l’étiologie de la MP restent inconnus, des études portant sur les contributeurs génétiques et environnementaux à la MP sont nécessaires pour découvrir des méthodes de prévention, de gestion et de traitement. Une caractérisation appropriée de la perte neuronale dopaminergique peut être pertinente non seulement pour la recherche sur la MP, mais aussi pour d’autres troubles neurodégénératifs de plus en plus répandus.
Il existe des modèles génétiques et chimiques établis de neurodégénérescence dopaminergique dans le système modèle Caenorhabditis elegans, avec une visualisation facile de la neurobiologie soutenue par la transparence des nématodes et l’architecture neuronale invariante. En particulier, les changements morphologiques des neurones dopaminergiques hermaphrodites de C. elegans peuvent être visualisés à l’aide de souches avec des rapporteurs fluorescents pilotés par des promoteurs spécifiques aux cellules tels que le gène transporteur de dopamine dat-1, qui est exprimé exclusivement dans leurs huit neurones dopaminergiques.
Avec les capacités de ce système modèle et la technologie appropriée, de nombreux laboratoires ont étudié la neurodégénérescence dopaminergique. Cependant, il y a peu de cohérence dans la façon dont les données sont analysées et une grande partie de la littérature actuelle utilise des analyses de notation binaire qui capturent la présence de dégénérescence, mais pas tous les détails de la progression de la perte de neurones. Ici, nous introduisons un système de notation universel pour évaluer les changements morphologiques et la dégénérescence dans les dendrites du neurone céphalique de C. elegans. Cette échelle de sept points permet une analyse sur une gamme complète de morphologie de dendrite, allant des neurones sains à la perte complète de dendrite, en tenant compte des détails morphologiques, y compris les plis, les ramifications, les blebs et les cassures. Avec ce système de notation, les chercheurs peuvent quantifier les changements subtils liés à l’âge ainsi que les changements chimiques plus spectaculaires. Enfin, nous fournissons un ensemble pratique d’images avec des commentaires qui peuvent être utilisés pour entraîner, calibrer et évaluer la cohérence de notation des chercheurs nouveaux dans cette méthode. Cela devrait améliorer la cohérence à l’intérieur et entre les laboratoires, en augmentant la rigueur et la reproductibilité.

Le système de notation décrit ici a été utilisé pour évaluer la neurodégénérescence au stade larvaire L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans après une exposition à la roténone. Les résultats de cette expérience sont présentés à la figure 2 et représentent la capacité de notre système de notation à détecter et à quantifier des niveaux variables de dommages aux neurones dopaminergiques. La roténone est un inhibiteur naturel du complexe de chaîne de transport d’électrons I utilisé dans certains pesticides, piscicides et insecticides36,37. Notez que travailler avec des produits chimiques toxiques tels que la roténone est intrinsèquement dangereux et que tous les laboratoires doivent se conformer à toutes les réglementations d’utilisation et d’élimination établies par leurs institutions. Dans cette expérience, des expositions à la roténone liquide à deux doses, 0,03 μM et 0,5 μM, ainsi qu’un groupe témoin, ont été commencées immédiatement après une lyse à 0,5 M d’hydroxyde de sodium / 1% d’hypochlorite de sodium pour récolter des œufs38. Les œufs éclos dans un milieu K complet33,39 avec 0,25 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), et les vers sont restés dans le liquide pendant environ 48 heures jusqu’au milieu du stade larvaire L4, moment auquel ils ont été retirés de l’exposition chimique, et préparés, imagés et, en utilisant la figure 1 comme référence, notés selon les étapes du protocole ci-dessus. Pour la dose plus élevée de roténone de 0,5 μM, les œufs ont été récoltés 24 heures à l’avance pour tenir compte d’un retard de développement induit par la roténone et s’assurer que tous les vers étaient synchronisés au stade au moment de l’imagerie.
La figure 2 montre également comment notre laboratoire visualise les données recueillies à l’aide de ce système de notation. Dans cette figure, une réponse de neurodégénérescence dose-dépendante peut être appréciée et la ventilation spécifique de la distribution des scores est clairement affichée. Ces résultats particuliers montrent comment les dommages neuronaux peuvent se présenter de différentes manières. Par exemple, le groupe exposé à la roténone de 0,03 μM a une proportion réduite de neurones sains avec un score de 0, par rapport au groupe témoin, mais a également une proportion réduite de 5 scores. La détection de ce détail sur les distributions de scores entre les groupes expérimentaux met en évidence la sensibilité de notre système de notation à sept points. Ces données ont été analysées pour la signification statistique selon le protocole, en utilisant un test du chi carré pour l’indépendance avec une correction de Bonferroni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig01.jpg"> Graphique 1. Images représentatives du système d’altération morphologique des neurones dopaminergiques et de notation de la dégénérescence. Ce tableau consolidé contient des exemples de neurones à chaque score et est destiné à être utilisé comme référence pour la notation. Ici, chaque score étiqueté correspond à la dendrite la plus endommagée dans chaque ver, comme indiqué par la flèche dans chaque panneau. Ces images ont été prises en utilisant le protocole décrit dans cet article avec BY200 C. elegans. Veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 pour un ensemble d’images notées avec des commentaires à utiliser pour former les nouveaux utilisateurs de cette méthode de notation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig02.jpg"> Graphique 2. BY200 L4 scores de morphologie et de dégénérescence des neurones dopaminergiques après une exposition à la roténone. Cette figure montre des résultats représentatifs analysés à l’aide des méthodes de notation décrites ici. Les proportions plus élevées visualisées de neurones dopaminergiques endommagés avec des concentrations d’exposition à la roténone plus élevées ont été analysées statistiquement à l’aide de tests d’indépendance du chi carré. Les deux groupes de traitement à la roténone ont donné des valeurs de p statistiquement significatives par rapport au groupe témoin. Différentes lettres indiquent une différence statistique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Dossier supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/Supplemental_Training_Set_KM_V5.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/SupplementaryFile2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Dans cet article, nous monimons comment utiliser un système de notation à sept points pour quantifier de manière cohérente les changements dans la morphologie de la dendrite des neurones dopaminergiques chez C. elegans. Ce système est destiné à l’analyse des tests de neurodégénérescence dopaminergique utilisant des modèles génétiques, chimiques et basés sur l’âge des troubles neurodégénératifs.

Quantification des niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Dans cette vidéo, nous montrons comment utiliser un système de notation en sept points pour quantifier les changements dans la morphologie de la dendrite des neurones dopaminergiques chez C.elegans. Il existe actuellement une grande variation dans les méthodes analytiques de quantification de la neurodégénérescence chez les vers. De plus, certaines compétences existantes se concentrent uniquement sur les corps cellulaires et ne sont pas sensibles à certains types et niveaux de dommages.Le but de l’introduction de ce système de notation est de fournir la capacité de capturer une image complète de la neurodégénérescence à tous les niveaux de dommages, et de fournir un système universel pour soutenir la cohérence entre la recherche sur la neurodégénérescence dopaminergique de C.elegans. Ici, nous allons montrer comment imager les neurones sous fluorescence, attribuer des scores aux dendrites de ces neurones et prévisualiser comment afficher et interpréter les résultats. Pour chaque groupe expérimental, pipettez ou choisissez 20 à 30 vers vers une plateforme d’imagerie compatible avec le microscope d’imagerie.La plupart des plates-formes courantes comprennent des coussinets d’agarose à 2% montés sur des lames de verre avec un glissement de couverture, et des plaques de 96 puits contenant des volumes de puits supérieurs ou inférieurs à 100 microlitres de milieu liquide. Laissez les vers paralyser complètement. Cela peut prendre plusieurs minutes.Chargez la plate-forme d’imagerie préparée dans un microscope d’imagerie capable de capturer z-stack. Localisez la région de la tête du ver d’abord en champ lumineux, puis sous une fluorescence GFP couleur unique à l’aide du microscope imageur. Le ver est représenté ici dans un grossissement de 400x.Faites défiler le focus pour trouver les limites supérieure et inférieure où les dendrites sont claires. Définissez-les comme limites supérieure et inférieure pour la capture d’image z-stack. Sélectionnez l’emplacement souhaité.Ici, nous utilisons un micromètre. Cliquez pour capturer des images z-stack dans le canal de fluorescence GFP. Pour chaque pile z, ouvrez le fichier image à l’aide du logiciel de microscope ou d’un logiciel d’analyse d’image externe.Chargez la pile dans le logiciel et compressez la pile en une seule image aplatie. Alignez les images entre et au sein des groupes de traitement manuellement ou à l’aide d’un logiciel d’enroulement automatique. Travaillez avec une image de neurone à la fois.Choisissez l’une des quatre dendrites CEP à évaluer pour les blebs, les ruptures et les irrégularités, y compris les plis, les plis et les courbes. Il est recommandé de marquer de gauche à droite lorsque le nez est en haut de l’image pour assurer la répétabilité du score. À l’aide de ces instructions, attribuez une valeur de score à chaque dendrite.Attribuer un score de zéro pour les dendrites sans dommages visibles, un score de un pour les dendrites avec irrégularités mais sans blobbing ou rupture, un score de deux pour les dendrites avec moins de cinq blebs, un score de trois pour entre cinq et 10 blebs, un score de quatre pour plus de 10 blebs et/ou bris en supprimant jusqu’à 25% de la dendrite, un score de cinq pour la casse en supprimant 25 à 75% de la dendrite, et un score de six si plus de 75% de la dendrite est absent. Si plusieurs critères sont remplis au sein d’une même dendrite, considérez les critères correspondant au score le plus élevé. Ces images de notation représentatives trouvées dans la figure 1 de l’article associé à cette vidéo peuvent être utilisées comme référence.Pour démontrer la notation, nous allons passer en revue l’attribution de scores à quelques exemples d’images de neurones. Commencez par le plus dendrite supérieur, il n’y a pas de blebs, de cassures ou d’irrégularités visibles. Attribuez un score de zéro.La deuxième dendrite a environ 14 blebs et aucune cassures visibles. Attribuez une note de quatre. La troisième dendrite ne peut pas être vue dans son intégralité en raison du chevauchement avec la dendrite deux et ne peut pas être notée.La dendrite la plus en bas a environ 11 blebs et quelques cassures. Attribuez un score de cinq. Dans cette image, seules trois dendrites sont scorables, car une dendrite n’a pas été entièrement capturée dans la capture z-stack.Il n’y a pas de blebbing sur les trois dendrites visibles. Donc, cela serait noté de haut en bas comme un zéro, un zéro, et en raison du pli ici, un. Enfin, dans cette image, les quatre dendrites sont perdues à plus de 75%.Toutes les dendrites ici reçoivent une note de six. Enregistrez tous les scores. Les scores peuvent être sans insu pour le moment.Le modèle de score utilisé ici se trouve dans les fichiers supplémentaires. Divisez les scores de neurodégénérescence par le nombre total de dendrites notées dans le groupe de traitement. Présenter les données en proportion de dendrites au sein du groupe de traitement à chaque score de neurodégénérescence.Notre système de notation a été utilisé pour évaluer la neurodégénérescence au stade larvaire L4 BY200 C.elegans après une exposition à la roténone. Les données sont affichées ici avec les proportions du nombre total de dendrites à chaque valeur de score pour chaque groupe expérimental. Nous considérons chaque dendrite notée comme n 1.Dans cette figure, une réponse de neurodégénérescence dose-dépendante à l’exposition à la roténone peut être appréciée, et la ventilation spécifique de la distribution du score est clairement affichée. Ces groupes expérimentaux étaient statistiquement différents selon un test d’indépendance du Chi carré complété par une correction de Bonferroni pour de multiples comparaisons. Dans cette vidéo, nous avons démontré comment utiliser l’échelle de sept points développée dans notre laboratoire pour quantifier les niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C.elegans.L’utilisation de la méthode de notation favorise la cohérence dans l’analyse et permet de comparer les études de recherche sur la neurodégénérescence chez les vers. Notre système de notation peut être utilisé pour analyser les données dérivées des expériences de C.elegans qui utilisent des rapporteurs fluorescents spécifiques aux cellules, tels que le gène transporteur de dopamine dat-1 qui permet la visualisation des neurones dopaminergiques. Maintenant, veuillez trouver un ensemble pratique d’images avec des commentaires qui peuvent être utilisés pour entraîner, calibrer et évaluer la cohérence de notation des chercheurs nouveaux à cette méthode dans le matériel supplémentaire de cet article.

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Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Cette vidéo démontre l’évaluation des effets neurodégénératifs d’un produit chimique testé sur Caenorhabditis elegans avec des neurones marqués par fluorescence. Les neurones normaux montrent une fluorescence brillante du soma et des processus intacts, tandis qu’une fluorescence diminuée, un soma gonflé et des processus ponctués indiquent une neurodégénérescence.

Étude de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em&gt; Drosophila</em

Cette étude décrit des mesures quantitatives de la taille et de la localisation synaptiques, de la morphologie musculaire et de la forme mitochondriale chez C. elegans à l'aide d'outils de traitement d'image librement disponibles. Cette approche permet à des études futures chez C. elegans de comparer quantitativement l'étendue des changements structurels tissulaires et organllés résultant de mutations génétiques.

Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.

Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal ione hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines, pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires des maladies neurodégénératives associées à l’âge.

Modélisation des maladies neurodégénératives associées à l’âge à Caenorhabditis elegans

Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.

In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

Les nématodes Caenorhabditis elegans jeunes adultes sont exposés à différentes concentrations de pesticides commerciaux ou d’autres toxiques pendant 2 à 24 h. Ensuite, différents neurones peuvent être visualisés à l’aide de souches exprimant la fluorescence. Cet article montre comment exposer les nématodes aux pesticides et évaluer les dommages aux neurones.

Examen de l’effet des pesticides sur les neurones de Caenorhabditis elegans

Ce protocole fournit une approche standardisée pour l’imagerie de la morphologie mitochondriale dans plusieurs tissus de C. elegans au cours du vieillissement.

Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement

Apprenez à quantifier la neurodégénérescence dopaminergique chez Caenorhabditis elegans grâce à un système de notation à sept points. Cette méthode standardisée permet d'évaluer les altérations morphologiques dendritiques avec précision et cohérence.

Quantification des niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification des niveaux d’altération morphologique et de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez Caenorhabditis elegans

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