Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

Parce qu’il teste le flux de substrat mitochondrial qui peut être affecté par différentes pathologies ou traitements. Par exemple, aujourd’hui, nous allons l’utiliser pour révéler la réponse des cellules cancéreuses au traitement par la metformine. Il nécessite un nombre minimal de cellules tout en ayant suffisamment de répliques et un contrôle approprié pour chaque matériau distinct.

L’analyseur est destiné à la recherche uniquement. Cette technique peut identifier les erreurs dans le métabolisme mitochondrial et peut être utilisée pour évaluer les médicaments des guerriers affectant les mitochondries. Karolina Vaneckova, étudiante de premier cycle et technicienne de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer à ensemencer des cellules A549 à une densité de 20 000 cellules par puits en colonnes, deux à 11 d’une micro-plaque de culture cellulaire XF 96 d’hippocampe. Laisser les colonnes un et 12 vides comme puits d’arrière-plan. Remplissez les puits vides avec un volume égal du milieu de culture cellulaire, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pour la fixation cellulaire.

Après trois à quatre heures, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les puits. Traiter les colonnes du groupe expérimental de sept à 11 avec une metformine millimolaire et le groupe témoin avec un volume égal d’eau distillée stérile, puis renvoyer la plaque à l’incubateur. Pour hydrater les capteurs, pipettez 200 microlitres d’eau stérile par puits dans la plaque de service.

Ensuite, retournez soigneusement la cartouche du capteur tout en immergeant le capteur dans l’eau. Incuber la cartouche dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’au lendemain. Allumez l’analyseur et l’unité de commande.

Démarrez le logiciel de contrôle de l’instrument et d’acquisition de données, puis concevez le protocole d’essai tel que décrit dans le manuscrit textuel. Sous les définitions de groupe, créez quatre stratégies d’injection où le port A diffère selon le substrat injecté et nommez les stratégies d’après les substrats ou les abréviations. Assignez l’oligomycine au port B, le FCCP au port C et le mélange d’antimycine à la roténone A au port D.Créez et nommez huit groupes, sous la carte de plaque, attribuez des groupes aux puits correspondants.

Enregistrez ensuite le protocole en tant que modèle prêt à l’emploi. Laissez l’analyseur allumé pour permettre à la température de se stabiliser pendant la nuit. Le lendemain, jetez l’eau de la plaque utilitaire et ajoutez 200 microlitres de calibrant préchauffé par puits dans la plaque utilitaire.

Retournez la cartouche dans l’incubateur sans dioxyde de carbone jusqu’au moment du dosage. Maintenez une source d’humidité à l’intérieur de l’incubateur et éteignez ou réduisez la vitesse du ventilateur au minimum, afin d’éviter une évaporation rapide de l’étrier. Préparer cinq millilitres de la solution de travail des substrats et des inhibiteurs avec une solution de dosage mitochondriale préchauffée à deux fois, 5% de BSA et de l’eau stérile comme décrit dans le manuscrit du texte.

Ensuite, chargez les orifices de l’injecteur avec du substrat et des inhibiteurs comme décrit dans le manuscrit fiscal. Pour l’étalonnage sous l’onglet Exécuter le test, cliquez sur le début de l’exécution pour démarrer le test. Insérez la cartouche de censure chargée et attendez la fin de l’étalonnage.

Préparer un milieu d’essai de 20 millilitres en mélangeant deux fois la solution d’essai mitochondriale, de l’eau stérile et 5% de BSA dans un tube de 50 millilitres. Ajouter deux microlitres de 10 micromolaires recombinants perfringolysine O, pour atteindre une concentration d’un nanomolaire. Et re-suspendre le mélange avec un pipetage doux, en évitant les secousses et les vortex.

Incuber le tube à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Utilisez une pipette multicanal pour laver les cellules et les puits vides deux fois, en utilisant une solution de PBS sans calcium et magnésium préchauffée. Jetez le PBS et ajoutez 180 microlitres du milieu d’essai préchauffé pour la perméabilisation cellulaire.

Immédiatement après la perméabilisation, remplacez la plaque utilitaire de la cartouche de capteur étalonnée par la plaque de cellule contenant des cellules perméabilisées et commencez la mesure. Le groupe de traitement avait un taux plus élevé de respiration induite par le succinate. La réponse des cellules A549 au traitement par la metformine était supérieure à celle de l’hépatite G2. Pour la respiration induite par le malate de pyruvate, les cellules A549 ont montré une induction accrue par rapport aux cellules Hep G2 entre cinq et 15 minutes.

Des résultats similaires ont été obtenus pour la respiration induite par le malate de glutamate et la respiration induite par le malate de palmitoylcarnitine. Pour atteindre la bonne concentration de substrat et d’inhibiteurs. Le bon volume doit être chargé dans le bon port.

Lorsqu’un changement dans une voie métabolique d’un certain substrat est identifié, il sera nécessaire d’évaluer la fonction des enzymes et des transporteurs impliqués dans cette voie.